【摘要】：昆蟲病原真菌作為重要的生防資源,闡明其侵染致病的分子機(jī)制十分必要。O-甘露糖基轉(zhuǎn)移酶PMTs家族是真菌進(jìn)行蛋白糖基化修飾的重要酶類,在植物病原真菌和人類病原真菌中,PMTs影響真菌的生長發(fā)育,抗逆和毒力,但在昆蟲病原真菌中研究較少。本文將以模式昆蟲病原真菌綠僵菌為實(shí)驗(yàn)材料,采用基因敲除、干擾及回復(fù)策略分析了該家族的功能。主要研究結(jié)果如下:1.Ma Pmt1/2/4的敲除和干擾根據(jù)已知的綠僵菌全基因組序列和c DNA序列,克隆得到甘露糖基轉(zhuǎn)移酶PMT家族基因Ma Pmt1,Ma Pmt2,Ma Pmt4。分析該家族基因具有PMT蛋白的典型結(jié)構(gòu)。構(gòu)建Ma Pmt1、Ma Pmt4基因敲除載體和回復(fù)載體,轉(zhuǎn)化綠僵菌,PCR篩選和Southern雜交驗(yàn)證獲得Ma Pmt1、Ma Pmt4敲除菌株和回復(fù)菌株。構(gòu)建Ma Pmt2的干擾載體,并轉(zhuǎn)化綠僵菌,PCR篩選轉(zhuǎn)化子,確定各干擾菌株的干擾效率。2.Ma Pmt1/2/4對綠僵菌生長發(fā)育和抗逆的影響敲除Ma Pmt1對綠僵菌的萌發(fā)和產(chǎn)孢量無影響;敲除Ma Pmt4后,綠僵菌萌發(fā)速度減慢,但其產(chǎn)孢量無變化;干擾Pmt2后,綠僵菌萌發(fā)速度減慢,產(chǎn)孢量僅為WT的50%左右。Ma Pmt1、Ma Pmt2、Ma Pmt4的缺失或干擾后綠僵菌對紫外和濕熱的耐受能力下降。3.Ma Pmt1/2/4的缺失或干擾影響綠僵菌的毒力Ma Pmt1/2/4的缺失或干擾導(dǎo)致綠僵菌的毒力降低。敲除Ma Pmt1主要通過影響附著胞的膨壓降低綠僵菌毒力;干擾Ma Pmt2主要通過影響附著胞的形成和膨壓降低綠僵菌毒力;敲除Ma Pmt4主要通過影響附著胞的形成和膨壓以及昆蟲血淋巴中的生長降低綠僵菌毒力。4.Ma Pmt1/2/4的缺失或干擾,影響綠僵菌細(xì)胞壁的組分及結(jié)構(gòu)通過透射電鏡發(fā)現(xiàn),Ma Pmt1/2/4敲除或干擾菌株細(xì)胞壁變薄且細(xì)胞壁與細(xì)胞膜分界模糊。熒光抗體染色發(fā)現(xiàn),Ma Pmt1/2/4敲除或干擾菌株表面結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。細(xì)胞壁組成分析發(fā)現(xiàn),Ma Pmt1/2/4缺失或干擾菌株的甘露糖蛋白、幾丁質(zhì)含量顯著低于野生型菌株,而葡聚糖含量與野生型相比無顯著差異。該研究結(jié)果對于明確O-甘露糖基化修飾在綠僵菌中的作用,特別是O-甘露糖基化修飾的改變對綠僵菌細(xì)胞壁重要成分、結(jié)構(gòu)及侵染致病能力的影響,以及細(xì)胞壁組成、結(jié)構(gòu)與昆蟲病原真菌侵染致病的關(guān)系具有重要意義。
[Abstract]:As an important biocontrol resource, it is necessary to clarify the molecular mechanism of entomopathogenic fungi infection. O-mannose transferase PMTs family is an important enzyme for protein glycosylation modification of fungi. In plant pathogenic fungi and human pathogenic fungi, PMTs affects the growth and development, stress resistance and virulence of fungi, but few studies have been done in entomopathogenic fungi. Using the model entomopathogenic fungus Metarhizium anisopliae as the experimental material, the function of the family was analyzed by gene knockout, interference and recovery strategy. The main results are as follows: according to the known whole genome sequence and c DNA sequence of Metarhizium anisopliae, the gene Ma Pmt1,Ma Pmt2,Ma Pmt4. of mannose transferase PMT family was cloned by knockout and interference of 1.Ma Pmt1/2/4 in Metarhizium anisopliae. The typical structure of PMT protein was analyzed. Construction of Ma Pmt1,Ma Pmt4 gene knockout vector and recovery vector, transformation of Metarhizium anisopliae, PCR screening and Southern hybridization to obtain Ma Pmt1,Ma Pmt4 knockout strain and recovery strain. The interference vector of Ma Pmt2 was constructed and transformed into Metarhizium anisopliae. The transformants were screened by PCR. 2. The effect of Ma Pmt1/2/4 on growth, development and stress resistance of Metarhizium anisopliae. Knockout of Ma Pmt1 had no effect on germination and sporulation of Metarhizium anisopliae. After knockout of Ma Pmt4, the germination rate of Metarhizium anisopliae decreased, but the sporulation of Metarhizium anisopliae remained unchanged. After interfering with Pmt2, the germination rate of Metarhizium anisopliae slowed down, and the spore yield was only about 50% of that of WT. Ma Pmt1,Ma Pmt2, The resistance of Metarhizium anisopliae to ultraviolet and wet heat decreased after the deletion or interference of Ma Pmt4. The deletion or interference of 3.Ma Pmt1/2/4 affected the virulence of Metarhizium anisopliae. The deletion or interference of Ma Pmt1/2/4 resulted in the decrease of virulence of Metarhizium anisopliae. Knockout of Ma Pmt1 decreased the virulence of Metarhizium anisopliae mainly by affecting the inflating pressure of appressorium and interfering with Ma Pmt2 by affecting the formation of appressorium and expanding pressure to decrease the virulence of Metarhizium anisopliae. Knockout of Ma Pmt4 decreased the virulence of Metarhizium anisopliae mainly by affecting appressorium formation and swelling and the growth of insect hemolymph. 4. The deletion or interference of Ma Pmt1/2/4 and the composition and structure of cell wall of Metarhizium anisopliae were found by transmission electron microscopy. The cell wall of Ma Pmt1/2/4 knockout or interference strain became thinner and the boundary between cell wall and cell membrane was blurred. Fluorescent antibody staining showed that the surface structure of Ma Pmt1/2/4 knockout or interfering strain was changed. Cell wall composition analysis showed that the mannose protein and chitin content of Ma Pmt1/2/4-deficient or interfering strains were significantly lower than that of wild-type strains, but there was no significant difference in glucan content between wild-type strains and wild-type strains. The results of this study can be used to clarify the role of O-mannose glycosylation in Metarhizium anisopliae, especially the effect of O-mannose modification on the important components, structure and invading ability of Metarhizium anisopliae cell wall, as well as the composition of cell wall. The relationship between the structure of entomopathogenic fungi and the infection of entomopathogenic fungi is of great significance.
【學(xué)位授予單位】：重慶大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S476.1

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本文編號：2434935