【摘要】：棉鈴蟲是常見的農(nóng)業(yè)害蟲,危害多種重要經(jīng)濟作物。殺蟲劑的長期使用導致棉鈴蟲產(chǎn)生較強的抗藥性和Bt抗蟲棉耐受,因此迫切需要繼續(xù)開發(fā)安全高效的生物殺蟲劑。膽固醇運輸?shù)鞍?(SCP-2)是昆蟲體內(nèi)一種重要的非特異性固醇運輸?shù)鞍?為開發(fā)新型農(nóng)藥提供了優(yōu)良的潛在靶點。本研究從兩個方面展開,一方面運用NMR結構解析、分子對接、突變體功能測定等技術手段,在蛋白質(zhì)水平上分析棉鈴蟲SCP-2蛋白的三維結構和重要的功能位點,為基于HaSCP-2蛋白結構快速篩選棉鈴蟲抑制劑提供條件。取得如下研究結果：(1)構建pGEX-KG-HaSCP-2融合表達載體,使用終濃度0.2raM IPTG在28℃條件下誘導表達10 h、通過GST親和層析、Thrombin酶切、陰離子交換層析和分子篩柱分離,建立起HaSCP-2蛋白快速高效的表達純化程序。(2)基于文獻檢索、蛋白質(zhì)序列比對、MALDI-TOF質(zhì)譜和NMR HSQC譜圖分析等,對蛋白進行了截短優(yōu)化。通過去除HaSCP-2蛋白N端16個氨基酸、C末端4個氨基酸,同時添加TritonX- 100分子,成功獲得可用于NMR結構分析用蛋白樣品。NBD-膽固醇結合測定表明截短優(yōu)化后不改變蛋白和膽固醇的親和能力。(3)基于NMR技術獲得了HaSCP-2蛋白在溶液中的三維結構。結果顯示HaSCP-2蛋白由5個α-螺旋和4個β-折疊組成,4個β-折疊位于一個平面上和處于該平面同側(cè)的α-螺旋共同構成了包含入口和出口的內(nèi)部空腔,為脂類分子結合和轉(zhuǎn)運提供疏水性通道。結構比較發(fā)現(xiàn)該蛋白和兔源SCP-2蛋白的結構相似度最高,達到47%。HaSCP-2蛋白NMR結構數(shù)據(jù)已經(jīng)上傳PDB數(shù)據(jù)庫,登錄號為4UEI。(4)利用SYBYL-7.3進行蛋白和脂分子配體的柔性對接。對接結果顯示Y51、F53、F89、I91、F110、I117、Q131等位點可能是蛋白和固醇分子的結合位點。通過蛋白點突變和NBD-膽固醇結合測定發(fā)現(xiàn)Y51A,Y51W、F53A、F53W、F89A、F110W、I117M、Q131A等突變體蛋白和膽固醇結合能力下降,I91M突變體溶解性較差未能成功純化,表明這些位點可能是膽固醇和HaSCP-2蛋白結合時的相互作用位點。(5)分子對接顯示抑制劑AeSCPI-1和mangostin可以和HaSCP-2蛋白結合。競爭性結合測定顯示這兩種抑制劑均可以抑制HaSCP-2和NBD-膽固醇的結合。另外生物測定也發(fā)現(xiàn)3齡幼蟲飼喂這兩種抑制劑后,蟲體脂肪體內(nèi)膽固醇含量發(fā)生顯著下降。另一方面,本研究克隆和分析了調(diào)控棉鈴蟲SCP-2表達的SCPX/SCP-2基因啟動子序列,為后期研究該基因表達調(diào)控機理打下重要基礎。主要取得以下研究結果：(1)通過染色體步移,成功克隆了棉鈴蟲SCPX/SCP-2基因ORF區(qū)上游約8kb側(cè)翼序列。(2)構建截短啟動子/熒光素酶報告基因重組質(zhì)粒,采用雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)測定了啟動子不同區(qū)域的活性,結果表明其中位于3’端1.8kb區(qū)域啟動子最高,推測該區(qū)域?qū)φ{(diào)控HaSCP-X/SCP-2基因表達非常重要。(3)通過5’-RACE分析,發(fā)現(xiàn)棉鈴蟲SCP-X/SCP-2基因啟動子區(qū)存在多個轉(zhuǎn)錄起始位點,轉(zhuǎn)錄調(diào)控較為復雜。(4)HaSCPX/SCP-2啟動子的生物信息學分析發(fā)現(xiàn),該轉(zhuǎn)錄起始位點上游37nt區(qū)域可能存在CEBP、AP-1、TGIF等順式作用元件,這些元件的突變造成啟動子活性顯著降低,推測其為調(diào)控SCP-2表達的重要元件。本研究基于NMR技術首次獲得了鱗翅目昆蟲棉鈴蟲SCP-2蛋白的三維結構,探討了蛋白和膽固醇底物結合的功能位點,并克隆和分析了調(diào)控SCP-2表達的啟動子序列。研究為利用該潛在靶位點開發(fā)新型高效殺蟲劑提供了重要理論基礎。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：華中師范大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：Q78;S433

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本文編號：2417410