【摘要】：肽聚糖識別蛋白(peptidoglycan recognition proteins,PGRPs)作為一類模式識別受體(pattern recognition receptors,PRRs)特異性地識別肽聚糖(Petidoglycan, PGN),在先天性免疫反應中擔任著至關重要的角色。本文以鱗翅目夜蛾科昆蟲棉鈴蟲(Helicoverpa armigera)為研究對象,克隆得到了一個PGRP基因,命名為HaPGRP-D,并對其在棉鈴蟲先天性免疫應答中的功能進行了研究。主要實驗結(jié)果如下：1.HaPGRP-D基因的克隆及序列分析從棉鈴蟲血細胞轉(zhuǎn)錄組中鑒定到一個PGRP cDNA,將其命名為HaPGRP-D。 HaPGRP-D cDNA中包含了一個699 bp的ORF,編碼232個氨基酸。經(jīng)預測該基因編碼的蛋白質(zhì)具有一個信號肽序列(1-18 aa),一個PGRP結(jié)構(gòu)域(38-181 aa)和一個Ami 2結(jié)構(gòu)域(50-187 aa)。成熟蛋白的分子量(MW)為26.081 kDa,等電點(PI)為5.82。將HaPGRP-D與其他鱗翅目昆蟲PGRP進行序列多重比對分析,結(jié)果顯示HaPGRP-D的氨基酸序列與其他鱗翅目昆蟲PGRP具有較高的相似性。多重序列比對分析也顯示T7溶菌酶Zn2+結(jié)合和酰胺酶活性所必需的五個氨基酸位點在HaPGRP-D中也是保守的,這表明HaPGRP-D可能是一種酰胺酶型PGRP。2.HaPGRP-D組織特異性表達分析利用RT-PCR檢測HaPGRP-D在棉鈴蟲幼蟲四種組織(脂肪體、血細胞、中腸和表皮)中的表達情況。結(jié)果表明HaPGRP-D基因在中腸高表達,在血細胞中低表達。表皮和脂肪體中未檢測到HaPGRP-D基因的表達。3、細菌或凝膠珠誘導后血細胞中HaPGRP-D表達量的變化利用qRT-PCR檢測注射細菌或凝膠珠后棉鈴蟲幼蟲血細胞中HaPGRP-D表達量的變化。結(jié)果顯示：注射革蘭氏陰性(Gram-negative,G-)大腸桿菌(Escherichia coli)、革蘭氏陽性(Gram-positive,G+)金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)或Sephadex DEAE A-25凝膠珠都能夠誘導棉鈴蟲血細胞中HaPGRP-D基因表達量上調(diào)。4、重組蛋白原核表達和純化擴增HaPGRP-D成熟肽cDNA(編碼19-232 aa),并將其與pET-32a表達載體連接。將構(gòu)建好的pET-32a-PGRP-D重組表達載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21感受態(tài)細胞中,利用IPTG誘導rHaPGRP-D的表達。用High-Affinity Ni-NTA Resin純化rHaPGRP-D。純化出的rHaPGRP-D大小約40 kDa,與預期的分子量大小一致。5、HaPGRP-D蛋白體外活性分析利用獲得的HaPGRP-D重組蛋白開展了以下蛋白體外活性分析實驗：5.1與細菌的結(jié)合活性分析分析了rHaPGRP-D與E. coli和S. aureus這兩種細菌的結(jié)合活性。結(jié)果表明HaPGRP-D能夠直接結(jié)合到細菌表面,并且這種結(jié)合活性是Zn2+依賴型的。5.2凝集活性分析檢測了rHaPGRP-D對E. coli和S. aureus這兩種細菌的凝集活性。結(jié)果表明HaPGRP-D能夠以Zn2+依賴型的方式凝集細菌。5.3酰胺酶活性分析用S. aureus的PGNs檢測rHaPGRP-D的酰胺酶活性。實驗結(jié)果顯示在Zn2+存在時rHaPGRP-D能夠強烈地降解PGNs,沒有Zn2+存在時,rHaPGRP-D對PGNs的降解活性較弱。這一結(jié)果證明HaPGRP-D是一種Zn2+依賴的酰胺酶。5.4殺菌活性分析檢測了rHaPGRP-D對E. coli和S. aureus的殺菌活性。結(jié)果表明無論有無Zn2+的存在,rHaPGRP-D都能夠抑制E. coli的生長。只有、Zn2+存在時,rHaPGRP-D才能夠抑制S. aureus的生長。這些結(jié)果表明HaPGRP-D具有殺菌活性。5.5 HaPGRP-D促進血細胞的吞噬作用利用體外吞噬實驗檢測HaPGRP-D是否參與吞噬作用。結(jié)果顯示rHaPGRP-D實驗組中血細胞對細菌的吞噬指數(shù)和吞噬率都極其顯著的高于rTrx對照組。這一結(jié)果表明HaPGRP-D可能參與調(diào)控棉鈴蟲血細胞的吞噬作用。5.6 HaPGRP-D促進血細胞的包囊作用利用體外包囊實驗檢測HaPGRP-D是否參與包囊作用。結(jié)果顯示rHaPGRP-D實驗組中凝膠珠被血細胞包囊的包囊率極顯著地高于對照組。這表明HaPGRP-D可能參與調(diào)控棉鈴蟲血細胞的包囊作用。5.7 HaPGRP-D與血細胞的結(jié)合分析利用免疫細胞化學的方法檢測了rHaPGRP-D能否與棉鈴蟲血細胞結(jié)合。實驗結(jié)果表明rHaPGRP-D能夠結(jié)合到漿細胞和粒細胞的表面。綜上所述,上述實驗結(jié)果表明HaPGRP-D作為PRR、酰胺酶和調(diào)理素在棉鈴蟲的體液免疫和細胞免疫中起著非常重要的作用。
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【學位授予單位】：華中師范大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：S433;Q78

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1 李麗;HaPGRP-D基因在棉鈴蟲先天性免疫中的功能研究[D];華中師范大學;2015年

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本文編號：2390795