【摘要】：棉鈴蟲核型多角體病毒(Helicoverpa armigera nucleopolyhedrovirus,HearNPV)作為核型多角體病毒Group II中的代表物種,其基因組序列已在2001年被報道。相比模式物種苜蓿銀紋夜蛾多核型多角體病毒(Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus,Auca MNPV)的功能基因組學(xué)研究,HearNPV的ORFs僅有不到50%的被研究報道,而80%以上的AucaMNPV ORFs已經(jīng)得到了較好的詮釋。本文針對ha83和ha86兩個HearNPV的基因展開了研究。其中ha83在AucaMNPV中并無同源基因的報道,作為一個能編碼幾丁質(zhì)結(jié)合功能域(chitin binding dimain,CBD)的基因,本文對該基因的功能及其所編碼的CBD的功能進行了較深入的探討;ha86與AucaMNPV中的ac98為同源基因,編碼桿狀病毒的38K蛋白,是桿狀病毒的核心基因之一,本文針對其同源性,對ha86與其基因同源基因的功能進行了比較研究。取得的主要研究結(jié)果如下:I.Ha83的功能研究結(jié)果1.利用5’和3’RACE對ha83的轉(zhuǎn)錄本進行分析,結(jié)果表明ha83的轉(zhuǎn)錄起始位點位于其起始密碼子(ATG)上游的374 nt處,且這段5’非翻譯區(qū)包含有復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件——共包括兩個TATA box(分別位于-107和-293 nt處)、兩個晚期強啟動元件ATAAG(-202 nt處)和TAAG(-27 nt處)以及五個早期啟動元件CATT(分別位于-67、-187、-211、-255和-310 nt處),這預(yù)示著ha83的轉(zhuǎn)錄或許受到多因素的調(diào)控;ha83的多聚腺苷酸化終止信號序列(AATAAA)與終止密碼(TAA)相重疊,3’端的轉(zhuǎn)錄終止于其終止密碼子的下游16 nt處,具有典型的PolyA尾巴。2.針對Ha83中的已報道的CBD中所包含的6個保守的半胱氨酸(Cys),進行截短體研究。通過I-TASSER系統(tǒng)對Ha83及其CBD中保守Cys的截短體蛋白(TC151,TC142,TC128,TC118,TC113,TC71)結(jié)構(gòu)進行預(yù)測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)11、15、19號氨基酸殘基可能為Ha83及其CBD截短體的蛋白的配體結(jié)合位點。3.利用PCR技術(shù)針對Ha83及其CBD編碼區(qū)的6個保守Cys構(gòu)建了6個截短體的原核表達載體。通過原核表達和純化,對Ha83及其CBD截短體蛋白進行幾丁質(zhì)結(jié)合能力的檢測,結(jié)果表明被測蛋白與幾丁質(zhì)的結(jié)合能力會隨著Ha83蛋白CBD中的保守半胱氨酸的缺失而下降,其中缺失所有保守Cys的突變體蛋白TC71的Kd為7.6μM,而Ha83的Kd為0.62μM,即Ha83與幾丁質(zhì)的結(jié)合能力比TC71高出13倍以上。4.針對Ha83的CBD中的保守Cys,構(gòu)建了對Ha83及其CBD截短體蛋白的真核表達載體,旨在研究cbd與蛋白的亞細胞定位的關(guān)系。結(jié)果表明,ha83會在轉(zhuǎn)染后72小時全部轉(zhuǎn)移到細胞核中,而缺失了cys128、cys118、cys113、以及cys71的ha83突變體蛋白,在轉(zhuǎn)染后72小時失去了蛋白亞細胞定位的極性,即tc128,tc118,tc113,tc71并未全部被轉(zhuǎn)移至細胞核中,而是均勻的分布于整個細胞中。5.構(gòu)建了ha83缺失/修復(fù)系統(tǒng),通過對ha83的缺失體、恢復(fù)體以及野生型病毒在轉(zhuǎn)染hzam1細胞后的比較,發(fā)現(xiàn)ha83的缺失會導(dǎo)致bv病毒產(chǎn)量的降低但病毒dna的復(fù)制量卻會升高;ha83缺失型hearnpv在細胞水平上的感染能力相較恢復(fù)型病毒和野生型病毒有所下降。6.在透射電鏡以及掃描電鏡的觀察下,發(fā)現(xiàn)ha83的缺失會導(dǎo)致病毒多角體粒子的形狀發(fā)生改變,且缺失體病毒的多角體的直徑會比野生型病毒的多角體的直徑大25%左右。此外ha83的缺失還會導(dǎo)致單個多角體中所包含的odv病毒數(shù)量顯著減少,相較野生型病毒而言,ha83缺失型病毒的單個多角體odv含量減少了上百倍。7.為了進一步明確ha83與多角體的形成和odv的包埋之間的關(guān)系,對ha83缺失型以及野生型病毒轉(zhuǎn)染后的hzam1細胞中的病毒多角體結(jié)構(gòu)相關(guān)基因以及odv結(jié)構(gòu)相關(guān)基因進行了轉(zhuǎn)錄水平的檢測。結(jié)果表明,ha83的缺失會導(dǎo)致polyhedrin和p10這兩個多角體結(jié)構(gòu)相關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄水平的下調(diào),同時也會導(dǎo)致ha90、ha66、cg30、ha9、38k、p24、pif2、odv-e66、ha100、helicase、ie-1、lef-3、odv-e43、odv-e56這些odv結(jié)構(gòu)相關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄水平的下調(diào),但卻會意外的導(dǎo)致另外兩個odv結(jié)構(gòu)相關(guān)的基因ha40和gp41在轉(zhuǎn)錄水平的上調(diào)。iiha86的功能研究結(jié)果1.利用5’和3’race對ha86的轉(zhuǎn)錄本進行分析,結(jié)果表明ha86的轉(zhuǎn)錄起始位點位于其起始密碼子(atg)的上游208nt處。其5’非翻譯區(qū)含有1個晚期強啟動元件ataag(位于-136nt處)和2個早期啟動元件catt(分別位于-94和-197nt處);ha86無典型的多聚腺苷酸化終止信號序列;ha863’端的轉(zhuǎn)錄終止于終止密碼子的下游54nt處,具有典型的polya尾巴。2.利用反轉(zhuǎn)錄pcr以及westernblot技術(shù),對ha86的轉(zhuǎn)錄時相和表達時相進行了檢測。結(jié)果表明ha86在hearnpv感染hzam1細胞12小時后開始轉(zhuǎn)錄,并持續(xù)到感染后96小時;ha86在感染后24小時開始表達并持續(xù)到感染后96小時,是一個典型的晚期表達基因。3.通過blast分析,在ha86的135-202aa區(qū)間以及蛋白ac98(aucamnpv中與ha86同源的蛋白)的136-203aa區(qū)間均預(yù)測到了保守的類似鹵酸脫鹵酶水解酶結(jié)構(gòu)域(haloaciddehalogenase-likehydrolasesdomain,had)。通過同源性分析,這一had結(jié)構(gòu)域在桿狀病毒38k蛋白中保守性更高于38k蛋白之間的保守性,且had功能域中的第5、6、7、42、43號氨基酸極有可能是had與配體結(jié)合的位點。4.構(gòu)建了ha86缺失/修復(fù)系統(tǒng),通過對ha86的缺失型、恢復(fù)型以及野生型病毒在轉(zhuǎn)染HzAM1細胞后的比較,發(fā)現(xiàn)ha86的缺失會導(dǎo)致病毒無法產(chǎn)生具有感染能力的出芽病毒,但并不影響病毒DNA的復(fù)制;ha86缺失型病毒能產(chǎn)生形態(tài)正常的核衣殼病毒粒子,但無法形成含有ODV的包涵體病毒粒子,表明ha86可能與ODV的形成或是ODV的包埋有關(guān)。5.為了進一步確認ha86與ac98功能的異同以及HAD序列的重要性,借助Bac-to-Bac系統(tǒng)將HearNPV來源或AucaMNPV來源的38k以及HAD異源修復(fù)到ha86缺失型病毒中。結(jié)果發(fā)現(xiàn)ha86的缺失對病毒所造成的影響無法被其同源基因ac98或是HAD序列所補救,當(dāng)ha86缺失型病毒恢復(fù)了ac98、haHAD或是acHAD后,依舊無法產(chǎn)生具有感染能力的出芽型病毒粒子。6.構(gòu)建了一系列HearNPV來源或AucaMNPV來源的38k以及HAD融合HA-tag的真核表達HearNPV bacmid,將這些bacmid轉(zhuǎn)染Hz AM1細胞進行免疫共聚焦觀察。結(jié)果發(fā)現(xiàn)Ha86在轉(zhuǎn)染后18小時開始在細胞質(zhì)中表達,在轉(zhuǎn)染后24小時后均勻分布于整個細胞中;在轉(zhuǎn)染后60小時,Ha86在細胞內(nèi)大量堆積,大部分Ha86分布在細胞核中;在轉(zhuǎn)染后72小時,僅細胞核中檢測到Ha86的分布。Ha86在HzAM1細胞中的定位與已報道的同源蛋白Ac98在sf9細胞中的亞細胞定位完全相符,但Ac98、HaHAD以及AcHAD在HzAM1細胞中的亞細胞定位卻沒有類似Ha86的特異性,三者都均勻分布于細胞核和細胞質(zhì)中。7.通過對比Ha86多克隆抗體以及HA-tag標(biāo)簽抗體雜交的Western blot結(jié)果,發(fā)現(xiàn)Ha86與Ac98,或HaHAD與AcHAD的抗原性差異較大,說明兩種來源的蛋白在結(jié)構(gòu)上差異較大,這也是二者之間無法代替的原因之一。綜上所述,兩個基因的功能基本明確,其中ha83對HearNPV在宿主細胞中的生長以及組裝均有較大影響,其編碼的CBD與Ha83的亞細胞定位也存在關(guān)聯(lián);ha86雖然在很多方面都與已報道的同源基因ac98相似,但ha86不僅對HearNPV產(chǎn)生具有感染能力的出芽病毒是必需的,且該基因的功能是HAD編碼區(qū)或其它同源基因無法替代的。以上研究結(jié)論為深入理解HearNPV的功能基因組學(xué)奠定了基礎(chǔ)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S476.13
【相似文獻】
相關(guān)期刊論文 前10條
1 孟麗,戴思蘭;F3′5′H基因與藍色花的形成[J];分子植物育種;2004年03期
2 劉薇;;利用雞胚模型進行基因功能研究的技術(shù)和方法[J];中國家禽;2009年12期
3 張水軍;曾千春;盧秀萍;李文正;;植物富含甘氨酸蛋白的研究進展[J];中國農(nóng)學(xué)通報;2010年14期
4 唐文惠;周蓉;陳佩林;;點雜交分析小鼠CRBN基因組織表達[J];湖北農(nóng)業(yè)科學(xué);2011年04期
5 申艷紅;陳曉靜;李榮榮;盧秉國;何瑋毅;;2個番木瓜多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白基因的克隆與分析[J];熱帶作物學(xué)報;2011年05期
6 郭志儒;一種快速關(guān)閉基因的新方法—RNAi[J];中國獸醫(yī)學(xué)報;2001年06期
7 唐小靜,李昱華,陳微,陳榮,程睿,李亦平;胚胎發(fā)育早期頭部特異表達的小鼠新基因BSG5的克隆及功能[J];動物學(xué)報;2004年04期
8 王鵬;韋月平;;β-Glucuronidase在植物基因功能研究中的應(yīng)用[J];吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院學(xué)報;2006年01期
9 張麗娟;羅軍;武會娟;劉俊霞;繩賀軍;韓雪峰;張寧;余剛;王海濱;;山羊與牛乳腺差異表達基因的篩選及半定量RT-PCR分析[J];動物學(xué)報;2007年04期
10 孫健;劉國振;;基因功能研究的加速器——高通量克隆表達系統(tǒng)[J];生物技術(shù)通報;2006年04期
相關(guān)會議論文 前9條
1 樊飛躍;曹珍山;朱茂祥;楊陟華;;輻射敏感基因功能研究[A];加入WTO和中國科技與可持續(xù)發(fā)展——挑戰(zhàn)與機遇、責(zé)任和對策（下冊）[C];2002年
2 張成崗;;后基因組時代的神經(jīng)系統(tǒng)基因功能研究[A];后基因組時代的基因功能研究——青年科學(xué)家論壇第八十次活動論文集[C];2003年
3 于典科;鮑曉明;;利用轉(zhuǎn)座標(biāo)簽大規(guī)模探尋釀酒酵母抗?jié)B抗鹽基因[A];山東微生物學(xué)會第六次會員代表大會暨2004年學(xué)術(shù)年會論文集（上）[C];2004年
4 謝玲;項曉瓊;胡迎春;范寶星;霍艷英;李邦印;段瑞峰;張開泰;吳德昌;;細胞定位與信號通路檢測技術(shù)在hrnt-1基因功能研究中的應(yīng)用[A];中華醫(yī)學(xué)會放射醫(yī)學(xué)與防護學(xué)分會第三次全中國青年學(xué)術(shù)交流會論文摘要匯編[C];2001年
5 彭連偉;張鳳;郭進魁;陳翠云;馬今方;蔡文和;張立新;;調(diào)節(jié)光系統(tǒng)Ⅱ電子傳遞的基因功能研究[A];中國植物生理學(xué)會第九次全國會議論文摘要匯編[C];2004年
6 尹仁福;劉新鑫;丁壯;劉美;王昌慶;李少麗;吳昊;邱蜜蜜;;攜帶EGFP基因RNAi載體的構(gòu)建與鑒定[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會禽病學(xué)分會第十四次學(xué)術(shù)研討會論文集[C];2008年
7 姜國勝;;重視罕見疾病研究[A];新觀點新學(xué)說學(xué)術(shù)沙龍文集50：我國罕見疾病研究關(guān)鍵問題與對策[C];2011年
8 朱妙春;呂炳斌;;我國基因?qū)＠Ｗo現(xiàn)狀及其倫理道德問題探討[A];入世后知識產(chǎn)權(quán)法律服務(wù)實務(wù)研討會暨全國律協(xié)知識產(chǎn)權(quán)專業(yè)委員會2002年年會論文匯編[C];2002年
9 秦玉芝;熊興耀;劉明月;;差異顯示技術(shù)在馬鈴薯基因功能研究中的應(yīng)用[A];馬鈴薯產(chǎn)業(yè)與糧食安全（2009）[C];2009年
相關(guān)重要報紙文章 前6條
1 通訊員 萬霞 陳軍 記者 劉志偉;我科學(xué)家發(fā)現(xiàn)新“疼痛基因”[N];科技日報;2013年
2 實習(xí)生 金雯玨 本報記者 王春;“夸娥”因子：快速識別基因身份[N];科技日報;2005年
3 王俊鳴;科學(xué)家繪出狗基因草圖[N];科技日報;2004年
4 李愛銘;解讀哺乳動物基因功能[N];解放日報;2005年
5 醫(yī)學(xué)院;倪建泉研究組在《美國科學(xué)院院刊》發(fā)文 揭示一種全新的基因編輯系統(tǒng)[N];新清華;2013年
6 本報駐倫敦記者;春去花不落 風(fēng)靜月長明[N];科技日報;2003年
相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條
1 李聰;CRISPR/Cas9技術(shù)對綿羊肌肉衛(wèi)星細胞MSTN基因的靶向敲除研究[D];中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2015年
2 時韋美;HBV感染相關(guān)的ADAR1基因功能研究[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2015年
3 馬燕;激素誘導(dǎo)風(fēng)信子花芽再生相關(guān)基因的表達模式及EST分析[D];山東農(nóng)業(yè)大學(xué);2003年
4 魯可可;人類hUFP基因初步研究[D];南京醫(yī)科大學(xué);2004年
5 張翼;豬Tiki基因的初步研究及Tiki1基因打靶載體的構(gòu)建[D];中國科學(xué)技術(shù)大學(xué);2011年
6 張顯;鴨瘟病毒UL29基因的原核表達、細胞定位及轉(zhuǎn)錄表達時相研究[D];四川農(nóng)業(yè)大學(xué);2009年
7 孫柏;雞Bcl10基因的克隆與表達[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2010年
8 鄭福軍;斑馬魚胚胎發(fā)育過程中cyclin C基因母型和合子型表達的初步研究[D];華東師范大學(xué);2005年
9 王玫玫;棉花促絲裂原活化蛋白激酶（GhMAPK）基因的分離與功能分析[D];山東農(nóng)業(yè)大學(xué);2007年
10 周璐;白氏文昌魚IKK基因的克隆及其免疫功能分析[D];南京師范大學(xué);2013年
，
本文編號：
2327025
