【摘要】：棉鈴蟲(chóng)核型多角體病毒(Helicoverpa armigera nucleopolyhedrovirus,HearNPV)作為核型多角體病毒Group II中的代表物種,其基因組序列已在2001年被報(bào)道。相比模式物種苜蓿銀紋夜蛾多核型多角體病毒(Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus,Auca MNPV)的功能基因組學(xué)研究,HearNPV的ORFs僅有不到50%的被研究報(bào)道,而80%以上的AucaMNPV ORFs已經(jīng)得到了較好的詮釋。本文針對(duì)ha83和ha86兩個(gè)HearNPV的基因展開(kāi)了研究。其中ha83在AucaMNPV中并無(wú)同源基因的報(bào)道,作為一個(gè)能編碼幾丁質(zhì)結(jié)合功能域(chitin binding dimain,CBD)的基因,本文對(duì)該基因的功能及其所編碼的CBD的功能進(jìn)行了較深入的探討;ha86與AucaMNPV中的ac98為同源基因,編碼桿狀病毒的38K蛋白,是桿狀病毒的核心基因之一,本文針對(duì)其同源性,對(duì)ha86與其基因同源基因的功能進(jìn)行了比較研究。取得的主要研究結(jié)果如下:I.Ha83的功能研究結(jié)果1.利用5’和3’RACE對(duì)ha83的轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行分析,結(jié)果表明ha83的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)位于其起始密碼子(ATG)上游的374 nt處,且這段5’非翻譯區(qū)包含有復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件——共包括兩個(gè)TATA box(分別位于-107和-293 nt處)、兩個(gè)晚期強(qiáng)啟動(dòng)元件ATAAG(-202 nt處)和TAAG(-27 nt處)以及五個(gè)早期啟動(dòng)元件CATT(分別位于-67、-187、-211、-255和-310 nt處),這預(yù)示著ha83的轉(zhuǎn)錄或許受到多因素的調(diào)控;ha83的多聚腺苷酸化終止信號(hào)序列(AATAAA)與終止密碼(TAA)相重疊,3’端的轉(zhuǎn)錄終止于其終止密碼子的下游16 nt處,具有典型的PolyA尾巴。2.針對(duì)Ha83中的已報(bào)道的CBD中所包含的6個(gè)保守的半胱氨酸(Cys),進(jìn)行截短體研究。通過(guò)I-TASSER系統(tǒng)對(duì)Ha83及其CBD中保守Cys的截短體蛋白(TC151,TC142,TC128,TC118,TC113,TC71)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)11、15、19號(hào)氨基酸殘基可能為Ha83及其CBD截短體的蛋白的配體結(jié)合位點(diǎn)。3.利用PCR技術(shù)針對(duì)Ha83及其CBD編碼區(qū)的6個(gè)保守Cys構(gòu)建了6個(gè)截短體的原核表達(dá)載體。通過(guò)原核表達(dá)和純化,對(duì)Ha83及其CBD截短體蛋白進(jìn)行幾丁質(zhì)結(jié)合能力的檢測(cè),結(jié)果表明被測(cè)蛋白與幾丁質(zhì)的結(jié)合能力會(huì)隨著Ha83蛋白CBD中的保守半胱氨酸的缺失而下降,其中缺失所有保守Cys的突變體蛋白TC71的Kd為7.6μM,而Ha83的Kd為0.62μM,即Ha83與幾丁質(zhì)的結(jié)合能力比TC71高出13倍以上。4.針對(duì)Ha83的CBD中的保守Cys,構(gòu)建了對(duì)Ha83及其CBD截短體蛋白的真核表達(dá)載體,旨在研究cbd與蛋白的亞細(xì)胞定位的關(guān)系。結(jié)果表明,ha83會(huì)在轉(zhuǎn)染后72小時(shí)全部轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中,而缺失了cys128、cys118、cys113、以及cys71的ha83突變體蛋白,在轉(zhuǎn)染后72小時(shí)失去了蛋白亞細(xì)胞定位的極性,即tc128,tc118,tc113,tc71并未全部被轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核中,而是均勻的分布于整個(gè)細(xì)胞中。5.構(gòu)建了ha83缺失/修復(fù)系統(tǒng),通過(guò)對(duì)ha83的缺失體、恢復(fù)體以及野生型病毒在轉(zhuǎn)染hzam1細(xì)胞后的比較,發(fā)現(xiàn)ha83的缺失會(huì)導(dǎo)致bv病毒產(chǎn)量的降低但病毒dna的復(fù)制量卻會(huì)升高;ha83缺失型hearnpv在細(xì)胞水平上的感染能力相較恢復(fù)型病毒和野生型病毒有所下降。6.在透射電鏡以及掃描電鏡的觀察下,發(fā)現(xiàn)ha83的缺失會(huì)導(dǎo)致病毒多角體粒子的形狀發(fā)生改變,且缺失體病毒的多角體的直徑會(huì)比野生型病毒的多角體的直徑大25%左右。此外ha83的缺失還會(huì)導(dǎo)致單個(gè)多角體中所包含的odv病毒數(shù)量顯著減少,相較野生型病毒而言,ha83缺失型病毒的單個(gè)多角體odv含量減少了上百倍。7.為了進(jìn)一步明確ha83與多角體的形成和odv的包埋之間的關(guān)系,對(duì)ha83缺失型以及野生型病毒轉(zhuǎn)染后的hzam1細(xì)胞中的病毒多角體結(jié)構(gòu)相關(guān)基因以及odv結(jié)構(gòu)相關(guān)基因進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄水平的檢測(cè)。結(jié)果表明,ha83的缺失會(huì)導(dǎo)致polyhedrin和p10這兩個(gè)多角體結(jié)構(gòu)相關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄水平的下調(diào),同時(shí)也會(huì)導(dǎo)致ha90、ha66、cg30、ha9、38k、p24、pif2、odv-e66、ha100、helicase、ie-1、lef-3、odv-e43、odv-e56這些odv結(jié)構(gòu)相關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄水平的下調(diào),但卻會(huì)意外的導(dǎo)致另外兩個(gè)odv結(jié)構(gòu)相關(guān)的基因ha40和gp41在轉(zhuǎn)錄水平的上調(diào)。iiha86的功能研究結(jié)果1.利用5’和3’race對(duì)ha86的轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行分析,結(jié)果表明ha86的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)位于其起始密碼子(atg)的上游208nt處。其5’非翻譯區(qū)含有1個(gè)晚期強(qiáng)啟動(dòng)元件ataag(位于-136nt處)和2個(gè)早期啟動(dòng)元件catt(分別位于-94和-197nt處);ha86無(wú)典型的多聚腺苷酸化終止信號(hào)序列;ha863’端的轉(zhuǎn)錄終止于終止密碼子的下游54nt處,具有典型的polya尾巴。2.利用反轉(zhuǎn)錄pcr以及westernblot技術(shù),對(duì)ha86的轉(zhuǎn)錄時(shí)相和表達(dá)時(shí)相進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果表明ha86在hearnpv感染hzam1細(xì)胞12小時(shí)后開(kāi)始轉(zhuǎn)錄,并持續(xù)到感染后96小時(shí);ha86在感染后24小時(shí)開(kāi)始表達(dá)并持續(xù)到感染后96小時(shí),是一個(gè)典型的晚期表達(dá)基因。3.通過(guò)blast分析,在ha86的135-202aa區(qū)間以及蛋白ac98(aucamnpv中與ha86同源的蛋白)的136-203aa區(qū)間均預(yù)測(cè)到了保守的類似鹵酸脫鹵酶水解酶結(jié)構(gòu)域(haloaciddehalogenase-likehydrolasesdomain,had)。通過(guò)同源性分析,這一had結(jié)構(gòu)域在桿狀病毒38k蛋白中保守性更高于38k蛋白之間的保守性,且had功能域中的第5、6、7、42、43號(hào)氨基酸極有可能是had與配體結(jié)合的位點(diǎn)。4.構(gòu)建了ha86缺失/修復(fù)系統(tǒng),通過(guò)對(duì)ha86的缺失型、恢復(fù)型以及野生型病毒在轉(zhuǎn)染HzAM1細(xì)胞后的比較,發(fā)現(xiàn)ha86的缺失會(huì)導(dǎo)致病毒無(wú)法產(chǎn)生具有感染能力的出芽病毒,但并不影響病毒DNA的復(fù)制;ha86缺失型病毒能產(chǎn)生形態(tài)正常的核衣殼病毒粒子,但無(wú)法形成含有ODV的包涵體病毒粒子,表明ha86可能與ODV的形成或是ODV的包埋有關(guān)。5.為了進(jìn)一步確認(rèn)ha86與ac98功能的異同以及HAD序列的重要性,借助Bac-to-Bac系統(tǒng)將HearNPV來(lái)源或AucaMNPV來(lái)源的38k以及HAD異源修復(fù)到ha86缺失型病毒中。結(jié)果發(fā)現(xiàn)ha86的缺失對(duì)病毒所造成的影響無(wú)法被其同源基因ac98或是HAD序列所補(bǔ)救,當(dāng)ha86缺失型病毒恢復(fù)了ac98、haHAD或是acHAD后,依舊無(wú)法產(chǎn)生具有感染能力的出芽型病毒粒子。6.構(gòu)建了一系列HearNPV來(lái)源或AucaMNPV來(lái)源的38k以及HAD融合HA-tag的真核表達(dá)HearNPV bacmid,將這些bacmid轉(zhuǎn)染Hz AM1細(xì)胞進(jìn)行免疫共聚焦觀察。結(jié)果發(fā)現(xiàn)Ha86在轉(zhuǎn)染后18小時(shí)開(kāi)始在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá),在轉(zhuǎn)染后24小時(shí)后均勻分布于整個(gè)細(xì)胞中;在轉(zhuǎn)染后60小時(shí),Ha86在細(xì)胞內(nèi)大量堆積,大部分Ha86分布在細(xì)胞核中;在轉(zhuǎn)染后72小時(shí),僅細(xì)胞核中檢測(cè)到Ha86的分布。Ha86在HzAM1細(xì)胞中的定位與已報(bào)道的同源蛋白Ac98在sf9細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位完全相符,但Ac98、HaHAD以及AcHAD在HzAM1細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位卻沒(méi)有類似Ha86的特異性,三者都均勻分布于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中。7.通過(guò)對(duì)比Ha86多克隆抗體以及HA-tag標(biāo)簽抗體雜交的Western blot結(jié)果,發(fā)現(xiàn)Ha86與Ac98,或HaHAD與AcHAD的抗原性差異較大,說(shuō)明兩種來(lái)源的蛋白在結(jié)構(gòu)上差異較大,這也是二者之間無(wú)法代替的原因之一。綜上所述,兩個(gè)基因的功能基本明確,其中ha83對(duì)HearNPV在宿主細(xì)胞中的生長(zhǎng)以及組裝均有較大影響,其編碼的CBD與Ha83的亞細(xì)胞定位也存在關(guān)聯(lián);ha86雖然在很多方面都與已報(bào)道的同源基因ac98相似,但ha86不僅對(duì)HearNPV產(chǎn)生具有感染能力的出芽病毒是必需的,且該基因的功能是HAD編碼區(qū)或其它同源基因無(wú)法替代的。以上研究結(jié)論為深入理解HearNPV的功能基因組學(xué)奠定了基礎(chǔ)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S476.13

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本文編號(hào)：2327025