發(fā)布時(shí)間：2018-11-05 06:51

【摘要】：非編碼RNA是指不編碼蛋白質(zhì)的RNA基因,主要包括小RNA(如miRNA等)和長的非編碼RNA(lncRNA)。研究表明,miRNA和lncRNA具有重要的功能。本文預(yù)測了五種昆蟲的非編碼RNA基因,通過基因家族分析發(fā)現(xiàn)了昆蟲特異性的miR-14,進(jìn)行了靶標(biāo)預(yù)測及雙熒光素酶報(bào)告基因驗(yàn)證,以及miR-14和其靶標(biāo)基因的表達(dá)分析,過表達(dá)或干擾miR-14的表達(dá)等實(shí)驗(yàn)表明,昆蟲特異性miR-14靶向蛻皮激素合成代謝通路中的9個(gè)基因,明顯增強(qiáng)了對通路的調(diào)控能力,在昆蟲蛻皮完成后抑制蛻皮激素的合成,維持了家蠶發(fā)育的穩(wěn)定性和一致性。主要工作如下:1、5種昆蟲非編碼RNA基因的發(fā)現(xiàn)及特征分析將褐飛虱、三化螟、甜菜夜蛾、小菜蛾、灰飛虱5個(gè)物種卵、幼蟲、蛹、成蟲等不同發(fā)育階段的個(gè)體分別混合,提取RNA,經(jīng)測序獲得5個(gè)物種小RNA序列,過濾后獲得五個(gè)物種Uniq reads信息。構(gòu)建miRNA預(yù)測流程,分別在褐飛虱、三化螟、甜菜夜蛾、小菜蛾、灰飛虱的小RNA文庫中發(fā)現(xiàn)了110、76、64、108、118個(gè)miRNA基因。收集褐飛虱低繁殖力雌成蟲、高繁殖力雌成蟲、低繁殖力五齡若蟲、高繁殖力五齡若蟲、Mudgo品系脂肪體、Taichung Native 1品系脂肪體、Mudgo品系唾液腺、Taichung Native1品系唾液腺、Izumo87品系、Chikugo89品系以及普通種群的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),構(gòu)建了lncRNA預(yù)測流程,從12個(gè)轉(zhuǎn)錄組中共發(fā)現(xiàn)1,882個(gè)lncRNA基因。褐飛虱lncRNA主要為兩個(gè)外顯子的轉(zhuǎn)錄本,轉(zhuǎn)錄本長度顯著短于蛋白質(zhì)編碼基因(841 bp vs 1106 bp,T-test,P0.01)。19%的褐飛虱lncRNA發(fā)生選擇性剪切。繁殖力與致害性種群中均存在特異性表達(dá)的lncRNA,且發(fā)現(xiàn)3個(gè)lncRNA基因與繁殖力密切相關(guān)的蛋白質(zhì)編碼基因發(fā)生重疊,表明lncRNA可能參與調(diào)控褐飛虱的繁殖力。2、昆蟲miRNA基因家族分析依據(jù)物種進(jìn)化關(guān)系,選取了5種脊椎動物(人、小鼠、家雞、非洲蟾蜍、斑馬魚)、17種昆蟲(二化螟、黑腹果蠅、意大利蜜蜂、麗蠅蛹集金小蜂、岡比亞按蚊、致倦庫蚊、埃及伊蚊、詩神袖蝶、煙草天蛾、家蠶、赤擬谷盜、豌豆蚜、褐飛虱、三化螟、甜菜夜蛾、小菜蛾、灰飛虱)、水蚤、線蟲和海蠕蟲共25個(gè)物種的miRNA�；蚣易宸治霭l(fā)現(xiàn),let-7、mir-1、mir-133等14個(gè)miRNA家族在所有物種中高度保守;bantam、mir-2、mir-263等9個(gè)miRNA家族在無脊椎動物中保守;mir-14、mir-277、mir-316、mir-932等為昆蟲特異性miRNA基因家族,其序列在昆蟲中高度保守。3、昆蟲特異性miR-14基因?qū)ν懫ぜに赝返恼{(diào)控選擇昆蟲特異性的miR-14基因開展功能研究。收集了12種昆蟲的miR-14基因序列以及3'UTR數(shù)據(jù),利用RNAhybrid和miRanda兩個(gè)軟件預(yù)測靶標(biāo),結(jié)果表明miR-14在所有昆蟲中靶向蛻皮激素通路中的多個(gè)基因。為進(jìn)一步分析昆蟲特異性的miR-14基因在變態(tài)發(fā)育中的調(diào)控功能,通過文獻(xiàn)挖掘構(gòu)建了昆蟲蛻皮激素的上游調(diào)控通路、合成通路及下游應(yīng)答通路(以下簡稱為昆蟲蛻皮激素通路),靶標(biāo)預(yù)測發(fā)現(xiàn)家蠶miR-14可作用于通路中的12個(gè)基因�？紤]家蠶3'UTR數(shù)據(jù)豐富及實(shí)驗(yàn)操作方便等優(yōu)點(diǎn),利用雙熒光素酶報(bào)告基因載體系統(tǒng)驗(yàn)證了預(yù)測靶標(biāo),分別將12個(gè)預(yù)測為靶標(biāo)基因的3'UTR克隆進(jìn)pMIR-REPORT載體,與miR-14的mimics共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞,測定熒光含量。同時(shí),對靶標(biāo)基因的3'UTR進(jìn)行了突變,檢測mimics的干擾效果是否有影響。結(jié)果表明,miR-14的mimics對攜帶有InR、Akt、Erk、Torso、Nvd、Shd、EcR、E74和等9個(gè)靶標(biāo)基因3'UTR的載體熒光素酶活性具有明顯的抑制作用,而當(dāng)3'UTR的靶標(biāo)位點(diǎn)被突變后,干擾作用消失。綜合軟件預(yù)測和靶標(biāo)驗(yàn)證的結(jié)果,表明miR-14對昆蟲蛻皮激素通路中的多個(gè)基因具有調(diào)控作用。分析認(rèn)為,這種作用模式顯著增強(qiáng)miR-14基因?qū)ν懫ぜに睾铣杉捌渥饔玫恼{(diào)控能力。lnR、Akt、Erk、Torso分別位于誘導(dǎo)和刺激蛻皮激素合成的三條上游調(diào)控通路上,Nvd,Shd等位于蛻皮激素的合成通路上,EcR、E74、Brc,是蛻皮激素的受體及下游應(yīng)答基因,通過對這9個(gè)基因的調(diào)控,miR-14可以成功地控制蛻皮激素的上游調(diào)控,合成及下游應(yīng)答通路,實(shí)現(xiàn)對蛻皮激素的全面調(diào)控作用。4、miR-14及靶標(biāo)基因的表達(dá)譜分析對家蠶頭、前胸腺、中腸、馬氏管和表皮五個(gè)組織進(jìn)行了miR-14的表達(dá)分析。結(jié)果表明,兩個(gè)miR-14成熟體(miR-14-5p和miR-14-3p)在五個(gè)組織中的表達(dá)量大致相似,miR-14為組成型表達(dá)的miRNA基因。對3齡第1天至蛹期第2天共18個(gè)樣本進(jìn)行了發(fā)育時(shí)期的表達(dá)分析,結(jié)果顯示miR-14在齡期轉(zhuǎn)換過程中呈規(guī)律性變化。miR-14-3p在每個(gè)齡期的第1天高表達(dá),miR-14-5p在每個(gè)齡期的最后一天高表達(dá)。為更細(xì)致地研究miR-14的表達(dá),對家蠶3齡第1天至4齡第1天每6h樣共20個(gè)樣本進(jìn)行了表達(dá)量分析。結(jié)果表明,miR-14-5p于蛻皮前24h表達(dá)開始上升,蛻皮前12h表達(dá)量升至最高,其表達(dá)量變化與蛻皮激素合成具有密切的關(guān)系。在需要蛻皮激素的發(fā)育時(shí)間點(diǎn)上,miR-14基因表達(dá)量降低。而在不需要蛻皮激素的時(shí)間點(diǎn)上,miR-14表達(dá)明顯升高。檢測了InR、Ras、Spo、Shd、EcR、E74、Brc等靶標(biāo)基因的表達(dá)情況,對3齡第1天至蛹期第2天共18個(gè)樣本進(jìn)行表達(dá)分析。結(jié)果表明,InR、Ras兩個(gè)基因的表達(dá)無明顯規(guī)律;E74基因在每個(gè)齡期最后一天高表達(dá);Brc在蛹期高表達(dá);Spo、Shd、EcR三個(gè)基因的表達(dá)趨勢一致,在每個(gè)齡期蛻皮前2天高表達(dá)。分析了Spo在家蠶3齡第1天至4齡第1天每6h樣本中的表達(dá),發(fā)現(xiàn)Spo于蛻皮前30h左右表達(dá)量升至最高。Spo與Shd基因直接參與蛻皮激素的合成,EcR基因?yàn)橥懫ぜに氐氖荏w基因,Spo、Shd、EcR三個(gè)基因的表達(dá)趨勢與蛻皮激素滴度的變化趨勢一致,與miR-14-5p的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。表達(dá)量分析結(jié)果,進(jìn)一步證明了miR-14-5p對蛻皮激素通路的調(diào)控作用。5、過表達(dá)與干擾miR-14對家蠶變態(tài)發(fā)育的影響合成了miR-14的類似物agomir-14,注射3齡2天家蠶,過表達(dá)家蠶miR-14。定量PCR檢測結(jié)果顯示,在三個(gè)重復(fù)中,過表達(dá)24 h后的表達(dá)量分別上升了3倍、8倍和22倍,過表達(dá)48h后仍可維持高豐度。注射不同濃度的agomir-14-5p均可致家蠶蛻皮延遲,注射540pmol agomir-14-5p致大約10%的家蠶個(gè)體蛻皮延遲,注射1080 pmol agomir-14-5p導(dǎo)致大約60%的家蠶個(gè)體蛻皮延遲,而agomir-14-3p組蛻皮時(shí)間與NC接近,表明家蠶中主要以miR-14-5p起作用。合成了miR-14的抑制劑antagomir-14,注射3齡1天家蠶,干擾miR-14的表達(dá)。利用qRT-PCR檢測干擾后24h和48h miR-14-5p的表達(dá)量,結(jié)果顯示干擾后兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)miR-14-5p的表達(dá)量均下降,其中48h達(dá)到顯著下降,表明注射antagomir-14達(dá)到了抑制miR-14表達(dá)的效果。antagomir-14-5p可致20-30%家蠶個(gè)體蛻皮延遲,而antagomir-14-3p蛻皮時(shí)間與NC接近。綜合過表達(dá)與干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果,表明家蠶miR-14-5p通過調(diào)控蛻皮激素通路基因的表達(dá),調(diào)控蛻皮激素的合成,進(jìn)而影響家蠶的變態(tài)發(fā)育。
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【學(xué)位授予單位】：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：Q963;S433

【參考文獻(xiàn)】

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1 James T. Warren;Lawrence I. Gilbert;;New players in the regulation of ecdysone biosynthesis[J];遺傳學(xué)報(bào);2008年01期

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本文編號：2311259