【摘要】：十字花科根腫病是由蕓薹根腫菌(Plasmodiophora brassicae Woron)侵染引起的一種世界性病害,嚴(yán)重危害十字花科作物的正常生產(chǎn)。CRb基因位于大白菜A3連鎖群23.67Mb-23.75Mb的區(qū)域內(nèi)。本研究在CRb基因初步定位的基礎(chǔ)上,利用圖位克隆法對其進(jìn)行分離克隆及功能鑒定。主要結(jié)果如下：1.CRb基因的精細(xì)定位及候選基因篩選：采用RCA法對CRb基因進(jìn)行精細(xì)定位,共顯性標(biāo)記TCR79和TCR74篩選1142株F2感病個體,獲得44株重組體,利用新開發(fā)的2個InDel標(biāo)記和1個SSR標(biāo)記,2個與TCR74共分離的共顯性標(biāo)記TCR30, TCR37以及1個顯性標(biāo)記TCR108對重組體進(jìn)行基因型鑒定,最終將CRb基因定位于0.07cM的區(qū)域內(nèi)。得到3個與CRb基因存在共分離關(guān)系的標(biāo)記。通過序列信息比對確定了2個能夠編碼TIR-NBS-LRR類的抗病蛋白的基因CRbl和CRb2為候選基因。2.CRb候選基因的克隆與結(jié)構(gòu)分析：利用改良RACE法對CRb候選基因進(jìn)行克隆,分別獲得3630bp的CRbl基因和3669bp的CRb2基因。NCBI conserve domain search預(yù)測2個候選基因的蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn),2個基因均能編碼TIR-NBS-LRR類蛋白。抗病基因與感病基因編碼的蛋白結(jié)構(gòu)對比結(jié)果表明,2個候選基因的蛋白結(jié)構(gòu)在抗病與感病材料之間均存在差異。進(jìn)一步確定這兩個基因即為CRb候選基因。3.CRb候選基因表達(dá)分析：通過對接菌后抗病及感病材料的葉片,葉柄,下胚軸以及根系中候選基因CRbl和CRb2的表達(dá)情況進(jìn)行分析,結(jié)果表明在這4個組織中候選基因均有表達(dá),且相對表達(dá)量在抗病與感病材料之間存在差異。但是僅在根系中CRbl和CRb2相對表達(dá)量的變化趨勢相對一致,在其他3個組織中相對表達(dá)量的變化不存在規(guī)律。4.CRb候選基因植物表達(dá)載體構(gòu)建及功能鑒定：利用酶切法構(gòu)建2個CRb候選基因的植物表達(dá)載體,農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化擬南芥獲得6個CRb1擬南芥轉(zhuǎn)基因株系,12個CRb2擬南芥轉(zhuǎn)基因株系�？共⌒澡b定結(jié)果表明2個候選基因的轉(zhuǎn)基因植株的病情指數(shù)均低于野生型擬南芥,進(jìn)一步說明2個基因在大白菜抗根腫病過程中均會發(fā)揮作用。5.CRb1和CRb2的系統(tǒng)發(fā)育分析：通過對蕓薹屬不同材料中的候選基因進(jìn)行擴(kuò)增,結(jié)果表明CRb1和CRb2僅存在于A基因組當(dāng)中。對這兩個基因進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析表明,19份抗病材料中的CRb1和CRb2基因均具有同源性,且CRbl在19份抗病材料中的同源性比CRb2在19份抗病材料中的同源性高,但抗病與感病材料之間的同源性,CRbl基因比CRb2基因要低。綜上所述,本研究利用圖位克隆法從CRb位點定位并克隆出2個TIR-NBS-LRR類抗病基因CRbl和CRb2；2個基因在抗感材料根系中的相對表達(dá)量存在差異,但調(diào)控水平一致；通過對轉(zhuǎn)基因擬南芥植株進(jìn)行抗病性鑒定表明,CRbl和CRb2基因在抗病過程中均能發(fā)揮作用；系統(tǒng)發(fā)育分析表明,這2個基因僅存在于蕓薹屬A基因組中,且2個基因在19份抗根腫病材料中的同源性均較高,推斷這2個基因在抗病材料中相對保守,因此能夠發(fā)揮抗根腫病的作用。
[Abstract]:Cruciferae root swelling is a worldwide disease caused by (Plasmodiophora brassicae Woron) infection of Brassica brassica, which seriously endangers the normal production of cruciferous crops. The CRb gene is located in the 23.67Mb-23.75Mb region of Chinese cabbage A3 linkage group. In this study, the CRb gene was isolated and cloned and its function was identified by map cloning. The main results are as follows: fine mapping of 1.CRb gene and screening of candidate genes: CRb gene was mapped by RCA method. 1142 F2 susceptible individuals were screened with codominant markers TCR79 and TCR74, and 44 recombinant strains were obtained. Two newly developed InDel markers and one SSR marker, two co-dominant marker TCR30, TCR37 and one dominant marker TCR108 were used to identify the genotype of the recombinant. Finally, the CRb gene was located in the region of 0.07cM. Three markers of cosegregation with CRb gene were obtained. Through sequence information alignment, two genes, CRbl and CRb2, which can encode TIR-NBS-LRR class disease resistance proteins were identified as candidate genes. The cloning and structure analysis of 2.CRb candidate genes were carried out. The modified RACE method was used to clone CRb candidate genes. The CRbl gene of 3630bp and the. NCBI conserve domain search of CRb2 gene of 3669bp were obtained to predict the protein structure of two candidate genes. Both genes can encode TIR-NBS-LRR protein. The results showed that the protein structures of the two candidate genes were different between disease-resistant and susceptible materials. 3.CRb candidate gene expression analysis: the expression of candidate genes CRbl and CRb2 in leaves, petioles, hypocotyls and roots of disease-resistant and susceptible materials were analyzed. The results showed that candidate genes were expressed in all of the four tissues, and the relative expression levels were different between disease-resistant and susceptible materials. However, the relative expression of CRbl and CRb2 in the root system showed the same trend. Construction and functional identification of 4.CRb candidate gene plant expression vector: two CRb candidate gene plant expression vectors were constructed by restriction endonuclease digestion. Agrobacterium tumefaciens mediated genetic transformation of Arabidopsis thaliana 6 CRb1 Arabidopsis transgenic lines and 12 CRb2 Arabidopsis transgenic lines were obtained. The disease index of transgenic plants with two candidate genes was lower than that of wild-type Arabidopsis thaliana. Phylogenetic analysis of 5.CRb1 and CRb2: by amplification of candidate genes in different materials of Brassica, the results showed that CRb1 and CRb2 existed only in A genome. Phylogenetic analysis of the two genes showed that both CRb1 and CRb2 genes were homologous in 19 resistant materials, and the homology of CRbl in 19 resistant materials was higher than that of CRb2 in 19 resistant materials. But the homology of CRbl gene was lower than that of CRb2 gene. In conclusion, two TIR-NBS-LRR resistance genes, CRbl and CRb2;, were mapped and cloned from CRb loci by map cloning. The relative expression levels of CRbl and CRb2; genes were different in the roots of the resistant materials, but the regulatory level was the same. The identification of resistance of transgenic Arabidopsis thaliana plants showed that both CRbl and CRb2 genes could play a role in the disease resistance, and phylogenetic analysis showed that the two genes existed only in the A genome of Brassica. The homology of two genes in 19 Rhizomegaly resistant materials was high. It was concluded that the two genes were relatively conserved in the resistant materials, so they could play the role of resistance to Rhizomegaly.
【學(xué)位授予單位】：沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S432.4

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本文編號：2287480