【摘要】：致病疫霉是一類世界性分布的毀滅性的植物致病菌,其有性生殖對該物種的生存及演化非常重要,但分子機理至今尚未闡明。在疫霉菌屬中發(fā)現一類新的G蛋白偶聯(lián)受體(G protein coupled receptors,GPCR),在其七次跨膜結構域的C端偶聯(lián)有一個磷脂酸肌醇激酶結構域(Phosphatidylinositol phosphate kinase,PIPK),該蛋白家族被命名為GPCR-PIPKs (GKs),共包括12個成員。本研究初步對致病疫霉GKs家族的Pi-PIPK-D8基因功能進行了研究分析。以致病疫霉HQK8-3為研究材料,通過綠色熒光蛋白表達載體建立了致病疫霉的遺傳轉化體系；通過實時定量RT-PCR技術,對致病疫霉不同發(fā)育階段的組織器官中Pi-PIPK-D8基因的表達進行了檢測；克隆致病疫霉Pi-PIPK-D8 cDNA蛋白編碼區(qū),構建了Pi-PPK-D8熒光蛋白融合表達載體,對Pi-PIPK-D8的亞細胞定位進行了檢測；通過電轉化將Pi-PIPK-D8的干擾載體pSTORA (A1935)轉入致病疫霉中,對干擾菌株的表型進行了分析,以揭示Pi-PIPK-D8基因的功能。實驗結果表明：(1)直接電轉化法對致病疫霉來說是一種可行的遺傳轉化方法,該法的轉化率約是原生質體轉化方法的2倍,且比原生質體轉化法更加簡單、快速；(2)致病疫霉菌株HQK8-3的Pi-PIPK-D8 cDNA蛋白編碼區(qū)序列為3045bp長,編碼的蛋白質含1015個氨基酸,與NCBI公布的序列長度及編碼蛋白質氨基酸數量相同。但該cDNA序列與NCBI公布序列有9個堿基差異,其編碼的蛋白質氨基酸序列與NCBI公布序列有3個氨基酸差異；(3)致病疫霉Pi-PIPK-D8在致病疫霉HQK8-3的休止孢中相對表達量最高,在萌發(fā)包囊、孢子囊、游動孢子和營養(yǎng)菌絲中依次減少；(4)致病疫霉Pi-PIPK-D8蛋白可能定位于菌絲內的顆粒狀結構中；(5)致病疫霉Pi-PIPK-D8沉默導致菌株的菌絲生長稀疏,孢子囊及游動孢子數量減少,與相反交配型菌株有性生殖產生的卵孢子數量減少,說明該基因參與致病疫霉菌絲的生長、孢子囊的產生和有性生殖。本研究揭示了致病疫霉Pi-PIPK-D8參與致病疫霉生長發(fā)育。對今后揭示致病疫霉一些重要生命現象的分子機理以及對該病害的有效防治具有重要的意義。
[Abstract]:Phytophthora infestans are a class of destructive plant pathogens distributed worldwide. Their sexual reproduction is very important to the survival and evolution of the species, but the molecular mechanism has not been elucidated up to now. A novel G-protein-coupled receptor (G protein coupled receptors,GPCR) was found in the genus Phytophthora, with a phosphatidylinositol kinase domain (Phosphatidylinositol phosphate kinase,PIPK) at the C-terminal of its seventh transmembrane domain. The family was named GPCR-PIPKs (GKs), which consists of 12 members. In this study, the function of Pi-PIPK-D8 gene in GKs family of Phytophthora infestans was preliminarily studied and analyzed. The genetic transformation system of Phytophthora infestans was established by using green fluorescent protein expression vector and real-time quantitative RT-PCR technique. The expression of Pi-PIPK-D8 gene in tissues and organs of Phytophthora infestans at different developmental stages was detected, the Pi-PIPK-D8 cDNA protein coding region of Phytophthora disease was cloned, the fusion expression vector of Pi-PPK-D8 fluorescent protein was constructed, and the subcellular localization of Pi-PIPK-D8 was detected. The interference vector pSTORA (A1935) of Pi-PIPK-D8 was transformed into Phytophthora infestans by electroporation. The phenotype of the interfering strain was analyzed in order to reveal the function of Pi-PIPK-D8 gene. The results showed that: (1) Direct electroporation was a feasible genetic transformation method for Phytophthora infestans. The transformation rate of this method was about 2 times of that of protoplast transformation and was simpler and faster than that of protoplast transformation. (2) the sequence of Pi-PIPK-D8 cDNA protein coding region of HQK8-3 was 3045bp long, and the encoded protein contained 1015 amino acids, which was the same as the length of the sequence published by NCBI and the amount of amino acid encoding protein. However, there were 9 bases difference between the cDNA sequence and the published sequence of NCBI, and the amino acid sequence of the protein encoded by the cDNA sequence was different from that of the published sequence of NCBI. (3) the relative expression of Pi-PIPK-D8 was the highest in the endosporal spores of Phytophthora infestans HQK8-3, and it was found in the germinating cysts. The number of sporangium, zoospore and vegetative hyphae decreased in turn; (4) the Pi-PIPK-D8 protein of Phytophthora disease may be located in the granular structure of mycelium; (5) Pi-PIPK-D8 silencing of Phytophthora pathogenicus resulted in sparse growth of hyphae, and decreased the number of sporangium and zoospore. On the contrary, the number of oospores produced by sexual reproduction of mating type strains decreased, indicating that the gene was involved in the growth of Phytophthora, sporangium production and sexual reproduction. This study revealed that Phytophthora Pi-PIPK-D8 was involved in the growth and development of Phytophthora. It is of great significance to reveal the molecular mechanism of some important life phenomena of Phytophthora infestans in the future and to control the disease effectively.
【學位授予單位】：內蒙古農業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：S432.4

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本文編號：2208152