本文選題：灰葡萄孢 + BcKMO��； 參考：《華北農(nóng)學(xué)報(bào)》2017年01期

【摘要】：為構(gòu)建灰葡萄孢犬尿氨酸單加氧酶(Bc KMO)基因的原核表達(dá)載體并進(jìn)行高效表達(dá),獲得純化的Bc KMO蛋白。以灰葡萄孢野生型BC22為試材,通過反轉(zhuǎn)錄PCR擴(kuò)增Bc KMO基因,回收Bc KMO基因片段克隆到p MD19-T載體中,測(cè)序正確后,酶切p MD19-T-Bc KMO和帶有GST標(biāo)簽蛋白的p GEX4T-1質(zhì)粒,將目的片段進(jìn)行連接,構(gòu)建Bc KMO基因的原核表達(dá)載體p GEX4T-1-Bc KMO-GST。經(jīng)酶切和測(cè)序鑒定正確后,將構(gòu)建好的原核載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21。經(jīng)IPTG誘導(dǎo),在大腸桿菌BL21菌株中成功表達(dá)了與GST標(biāo)簽蛋白融合的Bc KMO蛋白,大小約71 k Da。SDS-PAGE分析表明,該蛋白在0.2 mmol/L IPTG誘導(dǎo)12 h時(shí)高效表達(dá);Western Blot結(jié)果發(fā)現(xiàn)目的蛋白能與GST特異性抗體起特異性反應(yīng),表明Bc KMO基因的體外誘導(dǎo)表達(dá)成功。
[Abstract]:In order to construct the prokaryotic expression vector of uranine monooxygenase Bc KMOgene, a purified Bc KMO protein was obtained. Bc KMO gene was amplified by reverse transcription PCR from wild type BC22 of grapevine. The Bc KMO gene fragment was recovered and cloned into p MD19-T vector. After sequencing correctly, p MD19-T-Bc KMO and p GEX4T-1 plasmid with GST label protein were digested. The target fragment was ligated to construct the prokaryotic expression vector p GEX4T-1-Bc KMO-GST. of BC KMO gene. After restriction endonuclease digestion and sequencing, the constructed prokaryotic vector was transformed into Escherichia coli BL21. Bc KMO protein fused with GST tag protein was successfully expressed in Escherichia coli BL21 strain induced by IPTG. The size of Bc KMO protein was about 71 k Da.SDS-PAGE analysis. The protein was highly expressed 12 h after induction with 0.2 mmol/L IPTG. The results showed that the target protein could react specifically with the specific antibody of GST, which indicated that the Bc KMO gene was successfully expressed in vitro.
【作者單位】： 河北農(nóng)業(yè)大學(xué)真菌毒素與植物分子病理學(xué)實(shí)驗(yàn)室;
【基金】：河北省高等學(xué)�？茖W(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目(ZD2016001)
【分類號(hào)】：S432.44

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本文編號(hào)：1835732