本文選題：核盤菌 + Forkhead　； 參考：《吉林大學》2017年碩士論文

【摘要】：核盤菌(Sclerotinia sclerotiorum(Lib.)de Bary)是一種多寄主的死體營養(yǎng)型的植物病原真菌。核盤菌菌絲聚集形成的菌核能夠抵御各種物理,化學,以及微生物的破壞,在土壤當中可以保持活性達八年以上,在條件適宜的情況下菌核又可以萌發(fā)產(chǎn)生子囊盤,子囊盤釋放出的子囊孢子作為侵染源又會進行新一輪的病害循環(huán),因此菌核病是一種防治十分困難的病害,每年給農(nóng)業(yè)的生產(chǎn)帶來巨額的經(jīng)濟損失。在實驗室的前期研究中發(fā)現(xiàn),將Ss-Fox E2轉錄因子敲除之后,與野生型相比其對菌絲及菌核的發(fā)育,致病性方面無影響,但是在有性生殖階段無法產(chǎn)生子囊盤,表明Ss-Fox E2轉錄因子與核盤菌的有性發(fā)育相關;通過酵母雙雜交實驗篩選得到了9個可能與轉錄因子Ss-Fox E2互作的候選蛋白。本研究在此基礎之上,通過酵母雙雜交回轉驗證,雙分子熒光互補實驗驗證候選互作蛋白,并試圖通過染色質免疫共沉淀技術分析轉錄因子Ss-Fox E2下游調(diào)控的靶序列,從而初步建立起轉錄因子Ss-Fox E2的互作調(diào)控網(wǎng)絡,主要的研究結果如下:通過將候選基因的開放閱讀框構建到酵母雙雜交AD載體上,與連有轉錄因子Ss-Fox E2的誘餌載體共轉化到酵母菌株中,其中有6個共轉質�？梢约せ钕掠螆蟾婊�,且無自激活情況發(fā)生,證明得到了6個可以與轉錄因子Ss-Fox E2中Forkhead結構域互作的蛋白。之后又將9個候選基因的開放閱讀框構以及Ss-Fox E2的開放閱讀框構分別建到雙分子熒光互補載體p SAT4-c YFP/p SAT4-n YFP上,在激發(fā)光的照射下,有4個互作蛋白可以與轉錄因子Ss-Fox E2產(chǎn)生相互作用并發(fā)出黃色熒光,因此,通過酵母雙雜交回轉驗證及雙分子熒光互補實驗的驗證,篩掉具有假陽性的互作蛋白,共驗證得到4個與轉錄因子Ss-Fox E2互作的蛋白。染色體免疫共沉淀是研究纖轉錄因子Ss-Fox E2轉錄過程中與啟動子區(qū)互作所涉及的主要技術。該項技術難度較大、質量控制要求高,本研究對Ch IP實驗中的關鍵控制點進行摸索,其中超聲破碎條件則摸索為在20%的功率下,使用2mm直徑超聲波探頭,2s工作,2s間歇的工作狀態(tài)下,超聲總時間8-10分鐘時,染色體DNA斷裂程度可以達到500-1000bp之間;同時制備了ELISA效價達到1:50k,可以與轉錄因子Ss-Fox E2特異性結合的多克隆抗體,為穩(wěn)定實驗條件,獲取可靠數(shù)據(jù)和后續(xù)深入研究奠定基礎。以上各研究結論為下一步Ss-Fox E2互作蛋白的功能研究以及調(diào)控網(wǎng)絡的深入研究提供了基礎。
[Abstract]:Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary is a plant pathogenic fungus of the dead body type of multiple hosts. The sclerotia formed by the accumulation of mycelium of Sclerotinia mycelium can resist the destruction of various physical, chemical and microorganism, and can keep the activity for more than eight years in the soil, and the sclerotium can germinate under the condition of suitable conditions. The sac disk and the conidia released from the cysts of the cysts will carry out a new round of disease cycle as the source of infection, so Sclerotinia is a very difficult disease, which brings huge economic losses to the agricultural production every year. In the previous study of the laboratory, the Ss-Fox E2 transcription factor was knocked out and compared with the wild type. There was no influence on the development and pathogenicity of mycelium and sclerotium, but it was impossible to produce a sac in the sexual reproduction stage, indicating that the Ss-Fox E2 transcription factor was related to the sexual development of the fungus, and 9 possible candidate proteins interacting with the transcriptional factor Ss-Fox E2 were screened by yeast two hybrid experiment. The parent double hybrid gyration verification, the double molecular fluorescence complementary experiment verifies the candidate interaction protein, and attempts to analyze the target sequence regulated by the transcription factor Ss-Fox E2 downstream by chromatin immunoprecipitation technology, and thus initially establish the transcription factor Ss-Fox E2 interaction control network. The main results are as follows: through the opening of candidate genes, The frame was constructed on the yeast two hybrid AD vector, and the bait carrier, which had the transcription factor Ss-Fox E2, was transformed into the yeast strain. 6 of the co rotation plasmids could activate the downstream reporter gene, and there was no self activation. It was proved that 6 proteins that could interact with the Forkhead domain of the transcription factor E2 were obtained. After that, 9 of the proteins were found to be interacted with the Forkhead domain in the transcription factor E2. The open reading frame of the candidate genes and the open reading frame of Ss-Fox E2 were built on the double molecule fluorescent complementary carrier P SAT4-c YFP/p SAT4-n YFP. Under stimulated luminescence, 4 interacting proteins could interact with the transcription factor Ss-Fox E2 and emit yellow fluorescein. Therefore, the yeast two hybrid gyration was used to verify and be verified by the yeast two hybrid gyration. It was verified by the double molecular fluorescence complementary experiment that 4 proteins interacting with the transcription factor Ss-Fox E2 were screened out with the false positive interaction protein. The chromosome immunoprecipitation was the main technology involved in the interaction of the Ss-Fox E2 in the transcription factor of fibrin transcription factor and the promoter region. The technique was difficult and the quality control was high. In this study, the key control points in the Ch IP experiment were explored, in which the ultrasonic breakage conditions were found to be at 20% power, using the 2mm diameter ultrasonic probe, 2S work, and 2S intermittent working state. When the total ultrasonic time was 8-10 minutes, the chromosome DNA fracture degree could reach 500-1000bp, and ELISA titer reached 1:50k at the same time. The polyclonal antibody that can be specifically associated with the transcription factor Ss-Fox E2 is the basis for stabilizing the experimental conditions, obtaining reliable data and further research. The conclusions of the above studies provide the basis for the further research on the function of the next Ss-Fox E2 interaction protein and the in-depth study of the regulatory network.

【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：S432.44

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本文編號：1823698