本文選題：鏈霉菌 + 生物防治��； 參考：《中國計(jì)量大學(xué)》2016年碩士論文

【摘要】：放線菌是一類有巨大應(yīng)用價(jià)值的微生物類群,其次級代謝產(chǎn)物是開發(fā)新型生物農(nóng)藥防治植物真菌病害的主要來源之一,因此篩選具有拮抗作用放線菌是生物農(nóng)藥研究與開發(fā)的首要步驟。首先,本實(shí)驗(yàn)從我國多個(gè)省份的農(nóng)田、森林、濕地、溫泉、河床等不同的生態(tài)環(huán)境采集的土樣,最終分離獲得320株放線菌。黃瓜枯萎病是一類真菌性土傳病害,其病原菌為半知菌亞門鐮孢屬的尖孢鐮刀菌黃瓜�；�(Fusarium oxysporum f.sp.cucumerinum)。以黃瓜枯萎病菌(F.oxysporum f.sp.cucumerinum)為靶標(biāo)指示菌從中篩選得到了77株拮抗菌株,其中菌株M527不僅對F.oxysporum f.sp.cucumerinum的拮抗活性最強(qiáng),而且對多株植物病原真菌具有較強(qiáng)的拮抗活性。通過生長特性和生理生化特性分析,結(jié)合16S rRNA同源序列分析,對該菌株的菌屬進(jìn)行鑒定,確定為Streptomyces rimosus M527。S.rimosus M527的發(fā)酵液稀釋8倍后,仍能完全抑制F.oxysporum f.sp.cucumerinum的孢子萌發(fā)、菌絲生長;根據(jù)溫室黃瓜盆栽實(shí)驗(yàn),S.rimosus M527的發(fā)酵液不僅促進(jìn)黃瓜生長而且對黃瓜枯萎病有很好的抑制效果,使黃瓜植株的病情指數(shù)由71.1下降到20.0,治療效果為72.1%。其次以F.oxysporum f.sp.cucumerinum作為活性跟蹤指示菌,通過有機(jī)溶劑萃取、硅膠柱層析、DiaionHP-20凝膠柱層析、制備型HPLC對活性化合物進(jìn)行分離純化,結(jié)合MS、1H-NMR和13C-NMR波譜數(shù)據(jù)對活性化合物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析。從S.rimosus M527的發(fā)酵液中分離得到活性化合物—龜裂殺菌素,并對該化合物的HPLC檢測條件進(jìn)行優(yōu)化:色譜柱為ZORBAX SB-C18(150×4.6mm,5μm);檢測器為2998 PDA光電二極管檢測器;流動(dòng)相A為甲醇B為水(0.1%乙酸),梯度洗脫的程序如下:0~15 min,5%~70%A;15~25 min70%A;25~35 min 70%~100%A;35~45 min 100%~5%A;流速1 ml/min;檢測波長為304 nm;進(jìn)樣量為5μL,柱溫為室溫,對該色譜條件進(jìn)行探究,對該檢測方法的穩(wěn)定性、精確度等進(jìn)行評價(jià)。將粗提龜裂殺菌素稀釋系列濃度(mg/L):17.56;8.78;4.39;2.20;1.10;0.55;0.27;0.14,濃度為8.78 mg/L時(shí)能夠明顯抑制黃瓜枯萎病菌的菌絲生長;當(dāng)濃度為2.20 mg/L時(shí)可完全抑制黃瓜枯萎病菌的孢子萌發(fā)。17.56 mg/L的龜裂殺菌素溶液與傳統(tǒng)農(nóng)藥乙蒜素(80%)1000倍稀釋液進(jìn)行黃瓜盆栽實(shí)驗(yàn),施藥后14 d和21 d龜裂殺菌素的抑制效果分別為78.3%和70.6%,農(nóng)藥乙蒜素的抑制效果66.7%和42.7%。最后,為考察S.rimosus M527抗性基因otr A對模式菌株天藍(lán)色鏈霉菌(Streptomyces coelicolor)M145次級代謝產(chǎn)物的影響,以S.rimosus M527為研究材料,設(shè)計(jì)引物克隆了抗性基因otr A并將其置于鏈霉菌整合型載體pIB139中的Perm E*啟動(dòng)子下游,構(gòu)建了重組載體pIB139-otr A,通過接合轉(zhuǎn)移的方法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)移到S.coelicolor M145中獲得重組菌M145-OA。實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),重組菌M145-OA的產(chǎn)孢速度明顯高于原始菌株,另外將原始菌株M145與重組菌M145-OA進(jìn)行發(fā)酵性能比較,重組菌M145-OA中放線紫紅素產(chǎn)量比原始菌株M145提高近2倍。通過RT-PCR分析發(fā)現(xiàn),重組菌M145-OA中涉及放線紫紅素合成的調(diào)控基因ACT II-orf4轉(zhuǎn)錄水平與原始菌株的相比明顯增加,從而使得放線紫紅素產(chǎn)量的提高。
[Abstract]:Actinomyces is a kind of microorganism group with great application value , and the secondary metabolite is one of the main sources for the development of new biological pesticides to prevent and cure plant fungal diseases . A total of 77 antagonistic strains were isolated from fermentation broth of S . rimosus M527 . The results showed that recombinant plasmid pIB139 - otr A could inhibit the spore germination of Fusarium wilt of cucumber significantly when the concentration was 2 . 20 mg / L .

【學(xué)位授予單位】：中國計(jì)量大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S476.1

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本文編號：1813413