本文選題：銅綠假單胞菌 + 擬除蟲菊酯�。� 參考：《廣西大學(xué)》2015年博士論文

【摘要】：擬除蟲菊酯類農(nóng)藥是目前世界上使用最廣泛的殺蟲劑之一,在環(huán)境中的殘留和積累,給人類健康和生態(tài)系統(tǒng)造成了巨大的威脅。生物降解因為其高效、安全、無二次污染,已成為農(nóng)藥殘留修復(fù)的有效措施。本文首先對一株本實驗室前期篩選到的擬除蟲菊酯高效降解菌株GF31進行了16S rDNA分子進化分析,鑒定其為銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa),并提交中國普通微生物菌種保藏中心保藏(CGMCC 7173) 。對GF31的菊酯降解酶的定域?qū)嶒灡砻?酶活力主要位于胞外,占總酶活的81.5%, 說明其為胞外酶,這與目前普遍報道的胞內(nèi)菊酯降解酶不同。對產(chǎn)酶培養(yǎng)基進行了優(yōu)化,得到最優(yōu)培養(yǎng)基組成為：廢糖蜜5 g/L,蛋白胨10 g/L, NaH2PO4 0.12 g/L,苯丙氨酸1.0 g/L。培養(yǎng)到12 h時,再加入0.1%的吐溫80。菌株GF31的產(chǎn)酶量增加約2.6倍,為后續(xù)開展降解酶分離純化和結(jié)構(gòu)性質(zhì)等研究奠定了基礎(chǔ)。根據(jù)GF3的菊酯降解酶的基本性質(zhì)設(shè)計出一套分離純化方案,經(jīng)過超濾、鹽析、離子交換和凝膠層析四步純化,菊酯降解酶最終純化倍數(shù)為32.8倍,酶活回收率為26.6%,比酶活達到2571.9 U/mg。經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳檢測,表明純化酶已達電泳純,分子量約為53 KDa。對降解酶進行鑒定和結(jié)構(gòu)表征,測得其質(zhì)譜分子量為51 KDa,結(jié)合SDS-PAGE凝膠電泳結(jié)果,說明該酶是一個單亞基蛋白。測得其N-端氨基酸的順序為：NH2-Thr-Pro-Gly-Lys-Pro-Asn-Pro-Ser-Ile-Cys。經(jīng)還原和非還原的SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳,結(jié)果表明降解酶分子內(nèi)可能含有二硫鍵；糖基化測定結(jié)果表明降解酶不含或僅含極少量的糖。對純化酶的肽指紋圖譜進行數(shù)據(jù)庫檢索結(jié)果表明其與來源于Pseudomonas aeruginosa M18和PAO1的假定的氨肽酶具有很高的相似性,認為可能為同一種蛋白。根據(jù)Pseudomonas aeruginosa PAO1的aminopeptidase基因序列設(shè)計引物,通過PCR獲得了銅綠假單胞菌GF31的菊酯降解酶基因APs(在GeneBank中登記號為KT735188),并成功實現(xiàn)APs在大腸桿菌宿主中的異源表達。對菊酯降解酶基因APs進行生物信息學(xué)分析,結(jié)果表明該酶由536個氨基酸組成,前24個氨基酸為信號肽,第25-36個氨基酸為前導(dǎo)肽,隨后是500個氨基酸殘基的成熟蛋白,分子量為53.7 KDa,與純化蛋白的分子量相符。蛋白保守域分析和氨基酸序列分析的結(jié)果表明,菊酯降解酶APs屬于鋅-肽酶超家族(M28家族)的氨肽酶,具有氨肽酶典型的催化三元體(Glu341, Ser423和His296)以及與Zn配位的5個氨基酸殘基His296, Asp308, Glu341, Asp369,和His467。這是目前為止第一個報道的具有擬除蟲菊酯降解能力的氨肽酶。對菊酯降解酶APs的一級結(jié)構(gòu)進行了分析,與純化酶的氨基酸組成結(jié)果基本一致,僅Glu、GlyPro的含量誤差較大；對其二級結(jié)構(gòu)進行了預(yù)測,結(jié)果表明α螺旋含量為32.8%,p折疊含量為20.6%,無規(guī)則卷曲的含量為46.6%；以PDB蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中相同性最高的灰色鏈霉菌屬Streptomyces griseus氨肽酶為模板,利用同源建模法獲得APs三級結(jié)構(gòu)預(yù)測圖。對菊酯降解酶進行了比較系統(tǒng)的降解特性研究,為該酶的實際工程應(yīng)用提供理論依據(jù)。該酶的最適降解pH值為7.0,最適降解溫度為60℃；在70℃以內(nèi),pH5.0～9.0范圍內(nèi)均可保持良好的活性,表明該酶具有優(yōu)良的穩(wěn)定性；Ag+、Hg+和Cu2+對該酶有明顯的抑制作用,而其它金屬離子對其活性影響不大。離子螯合劑EDTA和phenanthroline對菊酯降解酶活力沒有抑制作用,說明菊酯降解酶活力不依賴于金屬離子。表面活性劑SDS和Triton X-100能夠明顯抑制菊酯降解酶活力。菊酯降解酶能催化降解氯氰菊酯、甲氰菊酯、氰戊菊酯和溴氰菊酯等多種擬除蟲菊酯,其中對氯氰菊酯降解活力最高。反應(yīng)動力學(xué)參數(shù)的測定結(jié)果表明,以氯氰菊酯為底物時,Vmax= 0.0017μM/s, Km=47.7μM,kcat=0.008 s-1;以L-亮氨酸.對硝基苯胺(Leu-pNA)為底物時,Vmax= 0.99μM/s, Km=2668.8μM,kcat=183.3s-1。表明菊酯降解酶能更高效的催化pNA底物,進一步確認其屬于氨肽酶。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：廣西大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：X592;X172

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本文編號：1767929