本文選題：農(nóng)桿菌T-復(fù)合物招募蛋白　切入點(diǎn)：atu5117基因啟動(dòng)子　出處：《揚(yáng)州大學(xué)》2015年碩士論文

【摘要】：農(nóng)桿菌是一類能夠在土壤中生存的植物病原菌。根癌農(nóng)桿菌能侵染受傷植物細(xì)胞,將自身基因插入到植物基因組內(nèi)遺傳表達(dá),借助農(nóng)桿菌的侵染,可實(shí)現(xiàn)外源基因向植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和整合,通過植物組織培養(yǎng)技術(shù),即可再生出轉(zhuǎn)基因植株。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化是植物轉(zhuǎn)基因和植物遺傳改良的首選方法,但其轉(zhuǎn)化效率低和轉(zhuǎn)化結(jié)果的不可預(yù)測性是該轉(zhuǎn)基因技術(shù)面臨的重要問題。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化是一個(gè)復(fù)雜的過程,涉及到農(nóng)桿菌細(xì)胞附著在植物細(xì)胞傷口,T-DNA在農(nóng)桿菌和宿主細(xì)胞中的轉(zhuǎn)移,T-DNA整合到宿主細(xì)胞及在宿主細(xì)胞內(nèi)的遺傳轉(zhuǎn)化等多個(gè)過程。我們嘗試進(jìn)一步了解農(nóng)桿菌T-DNA轉(zhuǎn)運(yùn)過程的分子機(jī)理,探討是否可以通過提高T-復(fù)合物招募蛋白VBPs在農(nóng)桿菌細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)活性來提高T-DNA的轉(zhuǎn)化效率,此研究對(duì)其在植物轉(zhuǎn)基因方面的應(yīng)用具有重要意義。本文對(duì)編碼農(nóng)桿菌T-復(fù)合物招募蛋白VBPs的基因atu5117啟動(dòng)子表達(dá)調(diào)控機(jī)理進(jìn)行了研究。在農(nóng)桿菌啟動(dòng)子基因表達(dá)調(diào)控機(jī)理的研究中,多以單熒光gfp基因作為啟動(dòng)子報(bào)告基因,但是表達(dá)產(chǎn)物除了受啟動(dòng)子因素的影響外還受載體拷貝數(shù)的影響,以往的單熒光gfp檢測方法不能排除載體拷貝數(shù)的干擾,使實(shí)驗(yàn)存在很大的誤差。為了解決上述問題,本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建雙熒光指示載體pUCA19-GFP/RFP紅色熒光蛋白rfp基因作為載體拷貝數(shù)的報(bào)告基因,以便了解不同實(shí)驗(yàn)條件下atu5117啟動(dòng)子基因表達(dá)調(diào)控過程中載體拷貝數(shù)的影響。將帶有,rfp基因的組成型表達(dá)的農(nóng)桿菌atu3617啟動(dòng)子和帶有g(shù)fp基因的農(nóng)桿菌atu5117啟動(dòng)子與農(nóng)桿菌表達(dá)載體pUCA19連接,構(gòu)建出雙熒光指示載體pUCA19-GFP/RF P,通過檢測該載體在不同菌種和不同環(huán)境條件下的熒光表達(dá)活性的不同,來對(duì)atu5117啟動(dòng)子的表達(dá)調(diào)控機(jī)理進(jìn)行研究。通過熒光檢測農(nóng)桿菌重組載體pUCA19-GFP/RFP能發(fā)出紅綠熒光,通過基因組測序檢測農(nóng)桿菌重組載體pUCA19-GFP/RFP含有雙熒光報(bào)告基因片段。檢測結(jié)果表明農(nóng)桿菌雙熒光指示載體pUCA19-GFP/RFP構(gòu)建成功。通過不同濃度蛋白測定熒光強(qiáng)度顯示,熒光強(qiáng)度與熒光蛋白表達(dá)量之間存在線性關(guān)系。在大腸桿菌異源表達(dá)調(diào)控實(shí)驗(yàn)中,大腸桿菌中atu5117啟動(dòng)子的表達(dá)活性明顯高于在農(nóng)桿菌GMI9017和農(nóng)桿菌GMI9017Δ2中的表達(dá)活性,atu5117啟動(dòng)子活性隨著生長期變化,在對(duì)數(shù)期活性最高,可以推測atu5117啟動(dòng)子的啟動(dòng)表達(dá)具有一定的時(shí)序性。在不同生長條件下,大腸桿菌中的農(nóng)桿菌atu5117啟動(dòng)子活性不受AS濃度影響,可能因?yàn)榇竽c桿菌中沒有VirA-VirG等AS的響應(yīng)機(jī)制。在堿性pH環(huán)境下,atu5117啟動(dòng)子啟動(dòng)表達(dá)活性變化不規(guī)律,在酸性pH環(huán)境下活性上升趨勢明顯,可能與農(nóng)桿菌侵染植物過程中對(duì)酸性物質(zhì)的趨化性相關(guān)。啟動(dòng)子活性受溫度的影響明顯,atu5117啟動(dòng)子活性隨著溫度上升,可能與細(xì)胞抵御高溫的機(jī)制有關(guān)。在農(nóng)桿菌表達(dá)調(diào)控實(shí)驗(yàn)中,atu5117啟動(dòng)子活性隨著生長期變化,啟動(dòng)子活性在對(duì)數(shù)期達(dá)到最大。在缺失同源基因atu4860的GM9017△2中,農(nóng)桿菌atu5117啟動(dòng)子的表達(dá)活性高于在GMI9017中的表達(dá)活性,atu5117啟動(dòng)子與同源基因tu4860啟動(dòng)子之間存在某些調(diào)控關(guān)系。在不同溫度和pH條件下,啟動(dòng)子活性變化和在大腸桿菌中類似。AS濃度影響的實(shí)驗(yàn)中,atu5117啟動(dòng)子活性變化不規(guī)律,其機(jī)理有待進(jìn)一步研究。
[Abstract]:Agrobacterium - mediated genetic transformation is one of the most important methods for the transfer and integration of exogenous gene to plant cells .

【學(xué)位授予單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S432.4

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