本文選題：粘蟲　切入點(diǎn)：胰蛋白酶　出處：《東北農(nóng)業(yè)大學(xué)》2015年碩士論文

【摘要】：絲氨酸蛋白酶(Serine Proteases,SPs)是一類以絲氨酸為活性中心的重要的蛋白水解酶,主要包括胰蛋白酶(EC號:3.4.21.4)和胰凝乳蛋白酶(EC號:3.4.21.1)。絲氨酸蛋白酶是鱗翅目昆蟲中最主要的消化酶,約占鱗翅目昆蟲中腸總消化酶活性的95%,在鱗翅目昆蟲的生理過程以及生長發(fā)育過程中起著重要的作用,主要參與食物消化、蛻皮過程和先天免疫反應(yīng)等重要的生理過程。此外,一些研究證明,鱗翅目昆蟲中腸絲氨酸蛋白酶參與Bt原毒素活化和毒素降解過程,昆蟲對Bt產(chǎn)生抗性有可能依賴于昆蟲腸道中絲氨酸蛋白酶表達(dá)水平或類型(例如胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶)的變化。因此鱗翅目昆蟲中腸的絲氨酸蛋白酶一直是研究的熱點(diǎn),逐漸成為害蟲防治的靶標(biāo),為新一代殺蟲劑的研發(fā)提供了一個方向。粘蟲Mythimna separata是亞洲國家糧食作物的重大害蟲,為了探索絲氨酸蛋白酶在粘蟲體內(nèi)的作用,本研究從粘蟲幼蟲中腸克隆得到一條胰蛋白酶類絲氨酸蛋白酶基因和一條胰凝乳蛋白酶類絲氨酸蛋白酶基因,分別命名為MsT(GenBank登錄號:KP730443)和MsCT(GenBank登錄號:KP730444),并將MsT和MsCT基因進(jìn)行了原核表達(dá)和活性測定。同時,對MsT基因和MsCT基因在不同組織和不同發(fā)育階段的轉(zhuǎn)錄水平,對于饑餓處理及再喂食后的轉(zhuǎn)錄反應(yīng),對于蛻皮激素(20E)的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)以及對于Cry1AC原毒素的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)都做了研究。最后,通過注射雙鏈RNA檢測了MsT和MsCT基因的RNA干擾效果。主要研究結(jié)果如下:1.MsT基因cDNA序列長856 bp,開放閱讀框(ORF)長765 bp,編碼255個氨基酸,蛋白質(zhì)分子量為27.1 kDa,等電點(diǎn)為9.04。由MsT推導(dǎo)出的氨基酸序列與鱗翅目昆蟲絲氨酸蛋白酶的氨基酸序列一致性在50%~84%之間,其中與蓓帶夜蛾Mamestra configurata(GenBank登錄號:ACR15970)胰蛋白酶類絲氨酸蛋白酶的氨基酸序列一致性最高,達(dá)84%。2.MsCT基因cDNA序列長971 bp,開放閱讀框(ORF)長891 bp,編碼297個氨基酸,蛋白質(zhì)分子量為31.0 kDa,等電點(diǎn)為8.63。由MsCT推導(dǎo)出的氨基酸序列與鱗翅目昆蟲絲氨酸蛋白酶的氨基酸序列一致性在44%~84%之間,其中與蓓帶夜蛾M.configurata(GenBank登錄號:ACR15972)胰凝乳蛋白酶類絲氨酸蛋白酶的氨基酸序列一致性最高,達(dá)84%。3.分別構(gòu)建重組載體MsT-pET21b和MsCT-pET21b轉(zhuǎn)化到大腸桿菌菌株E.coli BL21中進(jìn)行原核表達(dá),經(jīng)過SDS-PAGE和Western blot檢測確定為目的蛋白。蛋白可溶性分析發(fā)現(xiàn)重組蛋白為包涵體。將重組蛋白經(jīng)過變性、純化和復(fù)性處理后,以BApNA為底物,進(jìn)行活性測定。結(jié)果表明,在Tris-HCl緩沖液中,重組蛋白的活性隨著p H的提高而增大,到pH為9.5時,活性達(dá)到23.24 U/mL;在Glycine-Na OH緩沖液中,重組蛋白的活性隨著p H的變化先升高后降低,在p H為10.0時,活性達(dá)到最高,為35.74 U/mL。4.明確了MsT和MsCT基因在粘蟲不同組織和不同發(fā)育階段的轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在粘蟲的前腸、中腸、馬氏管、脂肪體和圍食膜都發(fā)現(xiàn)了MsT和MsCT基因的轉(zhuǎn)錄,特別是在圍食膜中,它們的轉(zhuǎn)錄水平達(dá)到最高;MsT和MsCT基因都主要在末齡幼蟲、預(yù)蛹和蛹的階段表達(dá),MsT基因在蛹期表達(dá)量最高,而MsCT基因在末齡幼蟲、預(yù)蛹和蛹期表達(dá)量相差不大。5.明確了Ms T和MsCT基因?qū)τ陴囸I處理及再喂食后的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)饑餓處理24h后,MsT和MsCT基因的表達(dá)量都明顯降低;同時,饑餓處理的幼蟲通過再次喂食后,MsT和MsCT基因的表達(dá)量又顯著升高。這些結(jié)果表明,Ms T和MsCT基因可能在粘蟲的食物消化過程中起到某種作用。6.明確了Ms T和MsCT基因?qū)τ谕懫ぜに?20E)的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對照相比,MsT基因的表達(dá)量在6齡幼蟲注射2μg蛻皮激素12 h后顯著升高,在24 h后表達(dá)量達(dá)到最高;而Ms CT基因的表達(dá)量在注射2μg蛻皮激素24 h后顯著降低。這些結(jié)果表明,Ms T基因可能在粘蟲的蛻皮過程中起到某種作用。7.明確了MsT和MsCT基因?qū)τ贑ry1AC原毒素的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對照相比,MsT基因的表達(dá)量不受Cry1Ac原毒素的影響,而MsCT基因的表達(dá)量在3齡幼蟲喂食用Cry1Ac原毒素浸泡過的玉米葉24 h后顯著升高。這些結(jié)果表明,MsCT基因可能在Bt原毒素的活化過程中起到某種作用。8.MsT和MsCT基因的RNA干擾研究表明,粘蟲4齡幼蟲注射4 ul含4ug的dsMsT和dsMsCT后,MsT和MsCT基因的轉(zhuǎn)錄水平在12 h后分別降低了76.69%和86.16%,且沉默效果在48 h后依然存在。同時,注射dsMsT和dsMsCT后,粘蟲4齡幼蟲的死亡率分別為26.66%和32.22%。
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【學(xué)位授予單位】：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S433.4

【參考文獻(xiàn)】

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1 李冬梅;孟凡立;王志坤;臧振源;孫晶;李文濱;;大豆食心蟲28SrDNA基因的克隆及表達(dá)分析[J];東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào);2012年07期

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本文編號：1715272