本文選題：真菌區(qū)系　切入點(diǎn)：細(xì)菌區(qū)系　出處：《南京農(nóng)業(yè)大學(xué)》2015年博士論文

【摘要】：植物長(zhǎng)期連作容易引起植物病原微生物富集,植物有益微生物數(shù)量減少,土壤微生物區(qū)系從細(xì)菌主導(dǎo)型向真菌主導(dǎo)型轉(zhuǎn)化,最終導(dǎo)致土壤微生物群落結(jié)構(gòu)與組成失衡,使病原菌更容易侵染植物而引起植物的各種土傳病害頻發(fā),如連作土傳枯萎病。因此對(duì)土壤微生物區(qū)系的研究對(duì)防控植物連作土傳病害具有重要的意義。本研究首先分析比較了不同的真菌標(biāo)靶基因(28S rRNA和ITS轉(zhuǎn)錄間隔區(qū))以及鑒定數(shù)據(jù)庫(kù)(LSU,WARCUP和UNITE)對(duì)真菌微生物區(qū)系測(cè)序數(shù)據(jù)分析結(jié)果的影響,得出適合用于本研究的真菌標(biāo)靶基因與鑒定數(shù)據(jù)庫(kù);進(jìn)而通過比較健康與發(fā)病香蕉根際土壤微生物區(qū)系差異得出健康香蕉根際土壤微生物群落的指示類群;進(jìn)而篩選出能有效抑制香蕉枯萎病病原菌尖孢鐮刀菌古巴�；�(Fusarium oxysporum f.sp.cubense,FOC)生長(zhǎng)的拮抗菌;將該拮抗菌進(jìn)行全基因組測(cè)序,進(jìn)一步分析其生防潛力;通過比較基因組研究設(shè)計(jì)能夠精確定量該拮抗菌的特異性引物;進(jìn)而測(cè)試該拮抗菌在土壤中的存活能力;最后將拮抗菌制成微生物有機(jī)肥(BIO),通過BIO營(yíng)養(yǎng)缽育苗以及在田間穴施BIO在香蕉根際培育一個(gè)以有益微生物為主導(dǎo)的健康微生物區(qū)系,從而起到防控香蕉土傳枯萎病的目的。主要研究結(jié)果有以下幾點(diǎn):1.選用不同的真菌標(biāo)靶基因(ITS,28S rRNA)與真菌鑒定數(shù)據(jù)庫(kù)(LSU,UNITE和WARCUP)對(duì)玉米,芒草與柳枝稷根際真菌群落的研究都得到一致的結(jié)論:一年生作物(玉米)的根際的真菌類群最特殊,作物類型是影響其根際真菌區(qū)系的首要因子。說明這些真菌標(biāo)靶基因與鑒定數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)揭示處理間真菌群落結(jié)構(gòu)的差異沒有很大影響。盡管如此,受標(biāo)靶基因引物覆蓋度以及真菌鑒定數(shù)據(jù)庫(kù)的覆蓋度與復(fù)雜性的影響,標(biāo)靶基因與數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)真菌高通量測(cè)序數(shù)據(jù)分析結(jié)果中的某些類群的相對(duì)豐度影響顯著。使用28S rRNA標(biāo)靶基因未能檢測(cè)到Fusarium,Phoma和Verticillum等真菌類群,而這些類群在使用ITS標(biāo)靶基因得到的分析結(jié)果中屬于相對(duì)豐度非常高的主要真菌類群,這些類群包含了著名的植物病原菌;而使用ITS標(biāo)靶基因未能檢測(cè)到Orbicula等真菌類群;Eupenicillium在使用ITS標(biāo)靶基因配合UNITE數(shù)據(jù)庫(kù)分析的結(jié)果中沒有出現(xiàn),在ITS標(biāo)靶基因配合WARCUP數(shù)據(jù)庫(kù)的分析結(jié)果中占比較小,而在28S rRNA配合LSU數(shù)據(jù)庫(kù)的分析結(jié)果中為第四名豐度最高的真菌類群。由于使用WARCUP數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)ITS序列進(jìn)行鑒定的結(jié)果在可鑒定類群數(shù)量與比例,鑒定結(jié)果有效性等方面都要優(yōu)于UNITE數(shù)據(jù)庫(kù),并且鑒于Fusarium真菌屬包含了本研究香蕉枯萎病的病原菌FOC,對(duì)本研究的意義重大,因此本研究關(guān)于香蕉根際真菌區(qū)系的研究選用ITS標(biāo)靶基因配合WARCUP真菌ITS數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行。2.香蕉根際微生物區(qū)系與香蕉植株健康狀況息息相關(guān)。16S rRNA基因克隆建庫(kù)測(cè)序的結(jié)果表明Bacillus是健康香蕉根際土壤中相對(duì)豐度最高的細(xì)菌類群;高通量測(cè)序結(jié)果表明,Bacillus是健康與發(fā)病香蕉植株根際細(xì)菌區(qū)系差異的主要貢獻(xiàn)者之一,是健康香蕉根際細(xì)菌區(qū)系的指示類群。健康的樣品中Bacillus的相對(duì)豐度顯著高于發(fā)病樣品。Fusarium是發(fā)病香蕉根際土壤中的主要類群,其在發(fā)病香蕉樣品中的相對(duì)豐度與數(shù)量要顯著高于健康樣品。Fusarium是指示健康與發(fā)病香蕉植株根際真菌區(qū)系差異的最主要貢獻(xiàn)者,是發(fā)病香蕉根際真菌區(qū)系的指示類群。Bacillus的相對(duì)豐度與Fusarium的相對(duì)豐度與數(shù)量呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系。根據(jù)以上結(jié)果推測(cè),如果能在香蕉根際增加Bacillus的數(shù)量而降低Fusarium的數(shù)量將有利于防控香蕉枯萎病,Bacillus與Fusarium的比值可以作為監(jiān)測(cè)預(yù)警香蕉枯萎病發(fā)生的指標(biāo)。3.將從健康香蕉根際土壤懸液中分離到的細(xì)菌菌落與香蕉枯萎病病原菌FOC進(jìn)行平板對(duì)峙培養(yǎng),獲得能高效抑制FOC生長(zhǎng)的菌株NJN-6。通過構(gòu)建16S rRNA發(fā)育樹以及將菌株NJN-6全基因組測(cè)序鑒定該菌株為Bacillus amyloliquefaciens。菌株NJN-6的全基因組注釋結(jié)果表明該菌株基因組含有一個(gè)由11個(gè)基因組成的合成penicillin的基因簇,擁有43個(gè)與脂肽類物質(zhì)合成相關(guān)的基因,91個(gè)與孢子產(chǎn)生和萌發(fā)相關(guān)的基因,是潛在的植物病害的生防菌。通過與菌株B.amyloliquefaciens FZB42的全基因組比較獲得菌株NJN-6基因組中的特異性片段,進(jìn)而設(shè)計(jì)得到用于精確定量NJN-6菌株的特異性引物,從而能夠在土壤中定量監(jiān)測(cè)菌株NJN-6的動(dòng)態(tài)變化,進(jìn)一步研究菌株NJN-6在土壤中的存活能力。菌株NJN-6土壤存活能力測(cè)試包括兩個(gè)處理:1)將菌株發(fā)酵液直接添加到土壤中(IS);2)將菌株發(fā)酵液與有機(jī)肥混合后制成微生物有機(jī)肥后添加到土壤中(BIO)。研究發(fā)現(xiàn)接種后,7天內(nèi)菌株NJN-6能在土壤中維持相對(duì)較高的數(shù)量,15天后數(shù)量驟減,30天后在土壤中的數(shù)量基本維持穩(wěn)定。添加有機(jī)肥有利于提高菌株NJN-6在土壤中的存活數(shù)量,減緩其死亡速率,有利于菌株NJN-6在土壤中發(fā)揮生防效果。4.將菌株NJN-6與氨基酸有機(jī)肥混合通過二次發(fā)酵制成BIO,并通過BIO營(yíng)養(yǎng)缽育苗以及田間穴施BIO顯著降低了香蕉枯萎病的發(fā)病率,生防率達(dá)68%,香蕉產(chǎn)量較對(duì)照處理翻了一番。高通量測(cè)序的結(jié)果再次證明Bacillus是健康香蕉根際土壤中相對(duì)豐度最高的細(xì)菌類群,是健康香蕉根際細(xì)菌區(qū)系的指示類群。發(fā)病香蕉根際土壤中Fusarium的數(shù)量顯著高于健康樣品。Fusarium的數(shù)量與香蕉產(chǎn)量呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系,與香蕉枯萎病發(fā)病率呈顯著正相關(guān)關(guān)系。Bacillus的相對(duì)豐度與Fusarium的數(shù)量呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系。香蕉植株健康狀況與香蕉根際細(xì)菌微生物區(qū)系具有顯著相關(guān)性,健康香蕉根際細(xì)菌微生物區(qū)系與發(fā)病樣品具有顯著差異。盡管如此,MRT分析表明BIO處理對(duì)香蕉根際細(xì)菌微生物區(qū)系的影響大于植株健康狀況對(duì)其的影響。BIO在香蕉根際培育了一個(gè)以有益微生物(Bacillus spp.)為主導(dǎo)的微生物區(qū)系,降低了FOC在根際的定殖數(shù)量,最終實(shí)現(xiàn)了防控香蕉土傳枯萎病的目的。本研究以香蕉枯萎病為例,展示了開發(fā)新型微生物有機(jī)肥防控土傳病害的整個(gè)過程:1)健康香蕉根際土壤微生物區(qū)系特征解析;2)拮抗菌篩選;3)微生物有機(jī)肥防控香蕉土傳枯萎病。發(fā)現(xiàn)了香蕉植株健康狀況與根際土壤微生物區(qū)系具有顯著相關(guān)性,確立了試圖通過調(diào)控香蕉根際土壤微生物區(qū)系以達(dá)到防控香蕉土傳枯萎病的理論基礎(chǔ)。并通過施用BIO成功地在香蕉根際構(gòu)建了一個(gè)以有益功能微生物為主導(dǎo)的土壤微生物區(qū)系,有效阻止了病原菌向香蕉根際的入侵,實(shí)現(xiàn)了有益菌促生和防病的雙重目的。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S436.68;S154.3

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本文編號(hào)：1714724