本文選題：長穗偃麥草　切入點：大米草　出處：《南京農(nóng)業(yè)大學(xué)》2015年碩士論文

【摘要】：玉米是第一大糧食作物,能在不同的土壤條件和氣候條件下種植。我國0.67億公頃耕地中鹽漬化土壤約占10%,但是玉米的耐鹽能力比較低,當(dāng)鹽度大于17 mmol·L~(-1)時,50%以上的植物生長受到抑制。鹽脅迫會引起玉米產(chǎn)量的降低。因此,研究玉米對鹽脅迫的響應(yīng)及其耐鹽機(jī)制,對于玉米耐鹽性改良具有非常重要的意義。然而,作為淡土植物的玉米,其耐鹽機(jī)制非常復(fù)雜,耐鹽性狀常表現(xiàn)為多基因控制的數(shù)量遺傳性狀。采用常規(guī)育種或分子育種手段提高玉米耐鹽性收效甚微。通過外源基因漸滲或轉(zhuǎn)基因途徑,利用野生耐鹽植物基因資源創(chuàng)制耐鹽玉米種質(zhì)是提高玉米耐鹽性的關(guān)鍵。目前,已有通過轉(zhuǎn)基因途徑提高玉米耐鹽性的報道。耐鹽轉(zhuǎn)基因植物培育的一般做法是根據(jù)人們對植物耐鹽機(jī)制的認(rèn)識,挑選少數(shù)被認(rèn)為與耐鹽相關(guān)的基因進(jìn)行操作,需要花費多年時間才能獲得轉(zhuǎn)基因植株,并且經(jīng)常出現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株目標(biāo)性狀表現(xiàn)不明顯,甚至與預(yù)期結(jié)果不一致的現(xiàn)象。這種做法的缺點是周期長、效率低,不能突破現(xiàn)有知識的框架。為了快速、高效篩選、應(yīng)用野生植物中的耐鹽基因資源,本試驗選擇耐鹽性較強(qiáng)的淡土植物—長穗偃麥草(Lophopyrum elongatumL.)和耐鹽性超強(qiáng)的鹽生C4植物—大米草(Spartin anglica Hubb)為材料,提取了不同濃度的NaCl和PEG-6000、不同處理時間下的幼苗RNA并等量混合。采用改良的SMART技術(shù)合成雙鏈cDNA后,用Gateway方法將cDNA文庫重組到植物轉(zhuǎn)基因雙元載體pMDC83,并將長穗偃麥草和大米草cDNA文庫分別導(dǎo)入玉米或煙草BY-2細(xì)胞中,初步建立了快速篩選并挖掘植物耐鹽基因的技術(shù)平臺。主要結(jié)果如下:分別以 100、200、300、400 mmol L~(-1) 的 NaCl 和 20%、30%、50%(w/v)的 PEG-6000處理長穗偃麥草幼苗1 d、3d、5 d、7d,用5%(w/v)NaCl處理大米草幼苗1 d、3 d、5 d、7 d,分別提取RNA后等量混合為總RNA。采用改良的SMART(switching mechanism at 5' end of RNA transcript)方法合成全長 cDNA 后,用 Gateway 技術(shù)中的BP反應(yīng)構(gòu)建了長穗偃麥草和大米草全長入門cDNA文庫,滴度分別為4.0× 1 06 cfu·mL~(-1)和4.3×106 cfu·mL~(-1),重組率均達(dá)98%以上。再采用LR反應(yīng),分別將兩個入門文庫重組到植物轉(zhuǎn)基因雙元載體pMDC83中,獲得目標(biāo)文庫。長穗偃麥草和大米草的目標(biāo)文庫原始滴度為6.O×106 cfu·mL~(-1)和5.7×106 cfu·mL~(-1),插入片段平均長度均為0.45 kb,重組率均達(dá)100%。從兩個目標(biāo)文庫中各隨機(jī)挑取5個陽性克隆進(jìn)行測序,并將測序結(jié)果在NCBI上進(jìn)行BLASTX比對,發(fā)現(xiàn)其中3個長穗偃麥草陽性克隆的插入片段分別與植物bZIP轉(zhuǎn)錄因子、細(xì)胞壁水解酶、衰老相關(guān)蛋白等有較高程度的相似性,但是其余7個序列未比對到相似序列。采用本實驗室建立的農(nóng)桿菌侵染萌發(fā)花粉再授粉的方法,將長穗偃麥草和大米草cDNA目標(biāo)文庫導(dǎo)入玉米,獲得了轉(zhuǎn)基因玉米T0代種子。通過對T0代玉米種子的GFP熒光信號的觀察、潮霉素抗性檢測和PCR驗證,證明外源基因成功導(dǎo)入玉米。用農(nóng)桿菌侵染法將農(nóng)桿菌與煙草BY-2細(xì)胞共培養(yǎng),將長穗偃麥草目標(biāo)文庫轉(zhuǎn)入煙草BY-2細(xì)胞中,在培養(yǎng)基中加入25mg·L~(-1)潮霉素和濃度分別為50mmol·L~(-1)、100 mmol·L~(-1) 和 200 mmol·L~(-1) 的 NaCl 對其進(jìn)行篩選,在 50 mmol-L~(-1)、100 mmol·L~(-1) 的鹽濃度下初步獲得耐鹽細(xì)胞系169個,而200 mmol·L~(-1) NaCl的鹽濃度下沒有發(fā)現(xiàn)耐鹽轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系。本文為大規(guī)�？焖俸Y選鑒定植株水平和細(xì)胞水平上的抗鹽基因奠定了基礎(chǔ)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S188

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：1660370