發(fā)布時間：2018-03-16 14:04

  本文選題：羅伯茨綠僵菌　切入點：G蛋白偶聯(lián)受體　出處：《安徽農(nóng)業(yè)大學》2015年碩士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：昆蟲病原真菌綠僵菌(Materhizium)作為殺蟲資源的種類之一,不僅具備真菌殺蟲劑的所有優(yōu)點,還具有安全、制劑易生產(chǎn)、貨架期長等優(yōu)點,被廣泛研究。據(jù)不完全統(tǒng)計,目前全世界超過200種農(nóng)林害蟲能被綠僵菌制劑寄生致死。然而,綠僵菌同其他微生物體農(nóng)藥一樣,也存在一些不足,例如昆蟲致死時間長,殺蟲效率較低,防效不穩(wěn)定等,嚴重限制其大規(guī)模應用。因此,系統(tǒng)深入理解昆蟲病原真菌致病的機制,可為高效殺蟲菌株的選育提供理論依據(jù)。G蛋白偶聯(lián)受體(GPCRs)是一類非常重要的信號分子受體,是真核生物中最大的一類跨膜蛋白家族。G蛋白偶聯(lián)受體在胞外信號向胞內(nèi)轉導的過程中起到重要的作用,調(diào)節(jié)控制著細胞內(nèi)的基因轉錄,細胞運動和生長�？梢哉fGPCRs調(diào)控著幾乎所有已知的生理過程,例如激素、生長因子、神經(jīng)遞質、氣味和光等介導的生理行為等都有G蛋白偶聯(lián)受體的參與。所以說,在生物體中,G蛋白偶聯(lián)受體有著不容忽視的重要作用。絲狀真菌雖然作為真核生物中最低等的部分,但是它們確是對人類生命活動的各個方面產(chǎn)生了深遠的影響,所以為了控制絲狀真菌對人類不利的一面,充分利用其有益的特性服務于人類,就必須深入的了解其生理、遺傳以及分子生物學方面的信息,并通過分子生物學手段對其進行有效改造。近年來有很多絲狀真菌的全基因組測序已經(jīng)完成或正在進行即將完成,于是乎對具體基因功能的研究就無可避免的成為了絲狀真菌研究的一個熱點,而這其中利用反向遺傳學的方法來敲除基因是研究絲狀真菌功能基因的常用方法之一。在對野生型羅伯茨綠僵菌(Mr23)孢子懸浮液進行40℃的水浴熱激,并對熱激后所形成的的表達譜的分析中,結果顯示G蛋白偶聯(lián)受體的基因表達是明顯上調(diào)的,所以我們可以推測得知在綠僵菌的抗逆境過程中,G蛋白偶聯(lián)受體起著很重要的作用。于是本文采取用結合基因敲除技術和農(nóng)桿菌介導遺傳轉化技術來完成對野生型羅伯茨綠僵菌(Metarhizium robberstii ARSEF 23)體內(nèi)G蛋白偶聯(lián)受體的基因功能的預測。首先查找出GPCRs在基因組中的位置,并找到其上游及下游序列,構建敲除的載體,通過將敲除載體轉化至根癌農(nóng)桿菌AGL-1中,獲得含有敲除質粒的農(nóng)桿菌菌株,將農(nóng)桿菌菌株與野生型羅伯茨綠僵菌(Mr23)共培養(yǎng),篩選出陽性菌株,即獲得了綠僵菌的敲除株,用同樣的方法構建回補突變的農(nóng)桿菌菌株,用其與綠僵菌敲除株共培養(yǎng),獲得綠僵菌回補菌株。將野生型羅伯茨綠僵菌菌株(Mr23),敲除菌株(△MrGPCR)和回補突變菌株(△MrGPCR::MrGPCR)進行相應的生物學特性的測定,抗逆性能的測定和相應毒力能力的測定,觀察比較,得出結論。從目前的狀況看來,在真菌中GPCRs的應用還是有限的,所以,在綠僵菌中研究GPCRs還是很有前景與價值的。所以本文采用用基因敲除技術與農(nóng)桿菌介導遺傳轉化技術來研究GPCRs在綠僵菌體內(nèi)的功能是具有一定的理論意義與實踐應用價值的,創(chuàng)新性很明顯。主要的研究結果結論如下:1.在NCBI中查找出G蛋白偶聯(lián)受體的序列,并找到在基因組中的位置,并且成功的構建了敲除質粒和回補質粒,獲得了敲除菌株和回補菌株。2.將野生型羅伯茨綠僵菌菌株(Mr23),敲除菌株(△MrGPCR)和回補突變菌株(△Mr GPCR::MrGPCR)分別選取14天的菌種,并且將其配置成孢子懸浮液,選取30μL孢懸液涂板接種在1/4 SDAY、SDAY和PDA培養(yǎng)基上(包括3組技術重復和3組生物重復),分別于14天和20天計算其產(chǎn)孢量。結果可知,與野生型綠僵菌(Metarhizium robberstii ARSEF 23)相比,敲除了GPCR的羅伯茨綠僵菌(△Mr GPCR)的產(chǎn)孢量有著明顯的下降趨勢。3.將野生型羅伯茨綠僵菌菌株(Mr23),敲除菌株(△MrGPCR)和回補突變菌株(△MrGPCR::MrGPCR)接種在SDAY培養(yǎng)基上,分別提取其RNA,查找相關產(chǎn)孢量的基因,并且通過實時熒光定量PCR方法,所得結果,可知大部分與產(chǎn)孢相關的基因都有下調(diào)趨勢,也是從分子的角度驗證了上述(結論2)產(chǎn)孢量有明顯下降的結果。4.將野生型羅伯茨綠僵菌菌株(Mr23),敲除菌株(△MrGPCR)和回補突變菌株(△MrGPCR::MrGPCR)的孢子懸浮液點接在含有各種試劑的PDA培養(yǎng)基上,每隔相應的時間段觀察其菌落生長直徑。結果可知,與野生型綠僵菌(Metarhizium robberstii ARSEF 23)相比,在NaCl、SDS、Congo red、H2O2和多菌靈抗性的培養(yǎng)基上,敲除了GPCRs的綠僵菌(△MrGPCR)對周圍環(huán)境的逆境適應性變強了,即對逆境的敏感度下降了。5.將野生型羅伯茨綠僵菌菌株(Mr23),敲除菌株(△MrGPCR)和回補突變菌株(△Mr GPCR::MrGPCR)的孢子懸浮液均勻的涂在PDA培養(yǎng)基上,培養(yǎng)14天后收集孢子,配置孢子懸浮液,用新鮮配置的孢子懸浮液來浸泡大蠟螟,對大蠟螟進行體表侵染。所得結果,可知與野生型綠僵菌(Metarhizium robberstii ARSEF 23)相比,敲除了GPCR的綠僵菌(△MrGPCR)的侵染大蠟螟能力減弱了,即毒力降低了。綜上所述,敲除了G蛋白偶聯(lián)受體的綠僵菌在逆境中適應性變強,產(chǎn)孢量減少,毒力減弱。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：安徽農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：S476.12

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本文編號：1620239