本文選題：禾谷鐮刀菌　切入點(diǎn)：RNA干擾　出處：《華中農(nóng)業(yè)大學(xué)》2015年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：禾谷鐮刀菌(Fusarium graminearum,Fg)是引起禾谷類作物赤霉病(Fusarium head blight)的主要病原菌,隨著全球溫室效應(yīng)的日益嚴(yán)重,赤霉病呈逐年蔓延之勢(shì)。禾谷鐮刀菌侵染可導(dǎo)致作物的產(chǎn)量和品質(zhì)下降,嚴(yán)重時(shí)顆粒無(wú)收;此外,禾谷鐮刀菌還會(huì)產(chǎn)生多種鐮刀菌毒素,嚴(yán)重影響人畜健康。禾谷鐮刀菌具有寄生范圍廣,不存在寄主�；偷忍攸c(diǎn),使得抗赤霉病研究工作舉步維艱。采用化學(xué)殺菌劑防治赤霉病易造成環(huán)境污染以及有益生物的非靶標(biāo)性殺滅;生物防治雖可以解決環(huán)境危害的問(wèn)題,但具有防治效果不穩(wěn)定的固有缺點(diǎn)。因此,開(kāi)發(fā)新的赤霉病防治策略成為當(dāng)前赤霉病研究工作的重要任務(wù)。RNA interference(RNAi)是真核生物中普遍存在的機(jī)制,利用RNA干擾技術(shù)防治作物病害成為目前作物病害防治研究工作的新手段。鐮刀菌細(xì)胞壁是鐮刀菌侵染植物過(guò)程中與植物最先接觸的結(jié)構(gòu),起到保護(hù)鐮刀菌細(xì)胞免受外界傷害的作用,同時(shí)也是鐮刀菌保持致病力和正常發(fā)育的必需結(jié)構(gòu)。本研究選取與鐮刀菌細(xì)胞壁形成有關(guān)的基因作為研究對(duì)象,分析了候選基因在鐮刀菌致病和生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的作用,并篩選出了用于RNAi抗赤霉病的有效基因片段。主要包括4項(xiàng)內(nèi)容:海藻糖六磷酸合酶基因(TPS1)和海藻糖六磷酸酯酶基因(TPS2)的功能鑒定;禾谷鐮刀菌RNAi體系的建立;利用RNAi技術(shù)鑒定幾丁質(zhì)合成酶基因Chs3b的功能及有效RNAi片段篩選;鐮刀菌單鏈抗體CWP2特異抗原乙二醛氧化酶(Glx)的功能鑒定。主要結(jié)果如下:1.TPS1、TPS2是禾谷鐮刀菌中海藻糖合成的兩個(gè)基因,本研究構(gòu)建了禾谷鐮刀菌TPS1、TPS2單基因缺失突變體(Δtps1,Δtps2)、TPS1和TPS2雙基因缺失突變體(Δtps1-Δtps2)以及TPS1、TPS2回復(fù)突變體(TPS1C,TPS2C),三個(gè)突變體均喪失了海藻糖合成的能力。Δtps1和Δtps1-Δtps2在發(fā)育和致病力方面與野生型無(wú)顯著差異,但影響毒素的合成能力,分別降低了67%和60%;TPS2基因缺失突變體表型與其他菌株區(qū)別明顯,在PDA培養(yǎng)基上,Δtps2突變體生長(zhǎng)緩慢,幾乎不能形成氣生菌絲;Δtps2完全喪失了產(chǎn)孢和有性生殖的能力;TPS2基因失活導(dǎo)致細(xì)胞向兩極生長(zhǎng)的趨勢(shì)降低,而轉(zhuǎn)為向側(cè)面生長(zhǎng),利用CFW和DAPI染色發(fā)現(xiàn),Δtps2分生孢子隔膜數(shù)減少,細(xì)胞核分布不均勻;Δtps2細(xì)胞壁超微結(jié)構(gòu)改變,相應(yīng)的幾丁質(zhì)含量和幾丁質(zhì)合成酶活性降低;Δtps2對(duì)小麥致病力極顯著降低,降低量達(dá)到99%,同時(shí)毒素合成能力降低了86%;轉(zhuǎn)錄組分析顯示,Δtps1、Δtps2和Δtps1-Δtps2分別有486、1885和146個(gè)特異基因差異表達(dá);Δtps1和Δtps1-Δtps2表達(dá)模式類似,與Δtps2差異明顯。2.建立了禾谷鐮刀菌rnai體系,該體系包括用于禾谷鐮刀菌單基因有效片段篩選的載體,禾谷鐮刀菌雙基因rnai載體,禾谷鐮刀菌雙啟動(dòng)子高效rnai載體以及禾谷鐮刀菌rnai快速構(gòu)建gateway載體系統(tǒng)。各載體如下:prnai是單基因有效片段篩選載體,可在smai和sacii酶切位點(diǎn)處導(dǎo)入基因片段的莖環(huán)結(jié)構(gòu),用于禾谷鐮刀菌單基因rna干擾;prnai-linker是雙基因rnai載體,可在smai/scai和sacii/swai酶切位點(diǎn)處連入基因片段的莖環(huán)結(jié)構(gòu),用于禾谷鐮刀菌雙基因rna干擾;prnai-dpromoter是雙啟動(dòng)子rnai載體,可在smai和sacii酶切位點(diǎn)處連入基因片段的莖環(huán)結(jié)構(gòu),高效干擾靶基因表達(dá);pdon201和psxsh-gatewayd分別是禾谷鐮刀菌gateway構(gòu)建體系的入門載體和目的載體,psxsh-gatewayd含有4段attl區(qū)域,只需pcr擴(kuò)增靶基因的正向序列即可完成含莖環(huán)結(jié)構(gòu)的rnai載體構(gòu)建。3.chs3b基因是禾谷鐮刀菌侵染小麥過(guò)程中表達(dá)量最高的幾丁質(zhì)合成酶基因;將chs3b基因以500bp左右為單位劃分為5段(15-583nt,570-1149nt,1130-1629nt,1612-2134nt,2104-2685nt)進(jìn)行rnai,各區(qū)段均可導(dǎo)致chs3b基因mrna轉(zhuǎn)錄水平下降,其中第1、3、5段引起的降低最大;當(dāng)chs3b基因的第1、3、5段被干擾后菌株在正常的pda培養(yǎng)基上生長(zhǎng)速率略低于野生型,向培養(yǎng)基中添加sds和h2o2的脅迫壓后,第1、2、3、5段干擾轉(zhuǎn)化子敏感性增加;chs3b基因第1段干擾轉(zhuǎn)化子在有性生殖條件下培養(yǎng)10d時(shí)不能產(chǎn)生子囊殼,產(chǎn)孢條件下培養(yǎng)5d時(shí)產(chǎn)孢較野生型降低了50%,第2段干擾轉(zhuǎn)化子有性生殖能力不受影響但產(chǎn)孢能力降低了64%;用cfw對(duì)各菌株的孢子和菌絲染色觀察發(fā)現(xiàn)第1和5段干擾轉(zhuǎn)化子的分生孢子隔膜數(shù)減少,孢子形態(tài)異常,菌絲出現(xiàn)膨大的結(jié)構(gòu);進(jìn)一步分析轉(zhuǎn)化子的幾丁質(zhì)含量發(fā)現(xiàn),第2、3、5段干擾轉(zhuǎn)化子幾丁質(zhì)含量顯著降低,第4段干擾轉(zhuǎn)化子菌株出現(xiàn)幾丁質(zhì)合成量上升的現(xiàn)象;通過(guò)苗期接種和花期接種鑒定致病力發(fā)現(xiàn),除第4段干擾轉(zhuǎn)化子外,chs3b基因的干擾轉(zhuǎn)化子致病力顯著降低;用生物信息手段分析chs3b基因的保守性發(fā)現(xiàn),chs3b基因在鐮刀菌中序列保守,其他物種中不存在脫靶效應(yīng);體外sirna干擾試驗(yàn)表明,sirna在禾谷鐮刀菌孢子萌發(fā)階段可進(jìn)入細(xì)胞內(nèi),細(xì)胞壁是sirna進(jìn)入鐮刀菌細(xì)胞的主要屏障。4.westernblot證實(shí)鐮刀菌抗體cwp2的特異抗原為乙二醛氧化酶蛋白glx;glx蛋白在鐮刀菌中催化合成h2o2,cwp2可抑制glx催化生成h2o2的能力;利用gfp標(biāo)記glx表明該蛋白位于鐮刀菌細(xì)胞膜;分別構(gòu)建禾谷鐮刀菌產(chǎn)don菌株fg5035、產(chǎn)niv菌株fg54606、串珠鐮刀菌fv5611和尖孢鐮刀菌fo297的glx突變體,對(duì)菌株致病力進(jìn)行了分析顯示:盡管各鐮刀菌glx缺失突變體生長(zhǎng)與野生型無(wú)顯著差異,但glx缺失突變體致病力顯著降低且毒素合成能力下降;對(duì)毒素合成基因的轉(zhuǎn)錄本分析發(fā)現(xiàn),GLX缺失突變體中毒素合成相關(guān)基因有不同程度的下調(diào)表達(dá)。綜上所述,本研究鑒定了3個(gè)與鐮刀菌細(xì)胞壁有關(guān)基因的功能,發(fā)現(xiàn)Chs3b基因和TPS2基因是禾谷鐮刀菌致病及發(fā)育的關(guān)鍵基因,GLX基因編碼蛋白是鐮刀菌抗體CWP2的特異抗原,該基因與鐮刀菌致病力和毒素合成有關(guān);建立了禾谷鐮刀菌RNAi的體系,并利用該體系篩選出了可用于RNAi抗赤霉病的有效基因片段Chs3b-1、Chs3b-3以及Chs3b-5。研究結(jié)果為抗赤霉病研究工作提供了有效的靶點(diǎn)以及理論支撐。
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【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S432.4
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本文編號(hào)：1590262