本文關(guān)鍵詞： 大麗輪枝菌 ATMT 突變體庫 表型篩選分析 致病相關(guān)基因　出處：《西北農(nóng)林科技大學(xué)》2015年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：在世界范圍內(nèi),由土壤傳播的病原體造成的植物維管束萎蔫病害是最具破壞性的植物病害。大麗輪枝菌是引起植物萎蔫病害的主要病原真菌,可侵染為害400多種植物,其中包括許多具有經(jīng)濟價值的作物。在中國,超過200萬公頃的棉花受到大麗輪枝菌的侵染,導(dǎo)致產(chǎn)量下降10-15%。本研究主要圍繞大麗輪枝菌展開。首先,我們用能夠侵染棉花的大麗輪枝菌落葉型菌株創(chuàng)立并優(yōu)化了ATMT轉(zhuǎn)化體系。用兩種農(nóng)桿菌菌株(AGL1和EHA105)轉(zhuǎn)化含有潮霉素篩選抗性的雙元載體pTC-Hyg到大麗輪枝菌XJ2008菌株中,并在優(yōu)化的條件下共培養(yǎng)以完成ATMT轉(zhuǎn)化過程。結(jié)果表明,在最優(yōu)條件下轉(zhuǎn)化效率可達100個轉(zhuǎn)化子/106個分生孢子。優(yōu)化后的ATMT轉(zhuǎn)化體系：取100μl新鮮的分生孢子懸浮液(106個分生孢子/ml)和農(nóng)桿菌菌液(0D600=0.8)等體積混合,涂布于鋪有玻璃紙的IM培養(yǎng)基(含有200μMAS)上。25℃條件下36h后,將玻璃紙轉(zhuǎn)至含有終濃度為200μg/ml頭孢霉素和50μg/ml潮霉素B的PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)5-7天篩選轉(zhuǎn)化子。AGL-1菌株轉(zhuǎn)化后得到的轉(zhuǎn)化子較多。這種優(yōu)化體系對于用大麗輪枝菌XJ2008菌株構(gòu)建插入突變體庫及后續(xù)通過插入突變的方法篩選致病相關(guān)基因起到了重要作用。通過插入突變,共得到4890個T-DNA插入突變體。隨機選取204個轉(zhuǎn)化子,從拷貝數(shù)、菌落生長速度、產(chǎn)孢和致病性等方面進行分析。結(jié)果表明突變株是單拷貝插入并且可以穩(wěn)定遺傳。與野生型菌株相比,突變體可以明顯的分為3種類型,34.7%的突變體的菌落生長速率顯著下降,34.8%的突變體的菌落生長速率增加,16.8%的突變體喪失產(chǎn)生微菌核的能力,30.0%的突變體的分生孢子形成能力減弱。通過數(shù)據(jù)分析,各突變體在PDA培養(yǎng)基上的生長速率和病情指數(shù)之間存在高度的相關(guān)性(R2=0.9129),可以用于獲得線性關(guān)系,并能合理解釋菌落大小的變化和其致病癥狀之間的關(guān)系,而最大孢子數(shù)量和菌落大小變化百分比也存在顯著相關(guān)性(R2=0.8936)。上述結(jié)果清楚地說明,突變體菌株的生長速率是其致病力的關(guān)鍵因素,尤其是當(dāng)孢子形成速率比對照野生型菌株低的時候。用浸根法篩選致病性缺陷突變體,在所有的突變體中有27.1%的突變體存在致病性缺陷,其中VdAG30、VdAG153和VdAG151對感病品種冀棉11的致病性大幅下降。TAIL-PCR產(chǎn)物測序結(jié)果顯示T-DNA區(qū)插入到一個在VdL17基因組中注釋為G蛋白偶聯(lián)受體的基因序列中,在基因組中命名為VDAG_04611.1。將T-DNA側(cè)翼序列與大麗輪枝菌基因組BLAST比對后發(fā)現(xiàn)該基因大小為1386 bp,位于8號染色體,含有三個大小分別為55bp、57bp和117 bp的內(nèi)含子。該項研究為克隆大麗輪枝菌致病相關(guān)基因和發(fā)育相關(guān)基因奠定了基礎(chǔ)。
[Abstract]:In this paper , we used two kinds of Agrobacterium strains ( AGL1 and EHA105 ) to transform the growth rate and the growth rate of the mutant .

【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S432.44

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本文編號：1543924