本文關鍵詞： DNA甲基化 DNA甲基化轉移酶 二斑葉螨 個體發(fā)育 色型 基因表達　出處：《南京農業(yè)大學》2015年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：基因組的信息包括遺傳信息與表觀遺傳信息兩大方面。其中,遺傳信息能夠為生命所需的蛋白質提供一個藍圖,而表觀遺傳信息則能夠指導這些遺傳信息以何種形式,何地以及何時被生物體所利用。而作為其中最為重要并廣泛存在于各生物中的就是基因的DNA甲基化作用。在真核生物中,DNA甲基化作用普遍發(fā)生在胞嘧啶的第五個碳上,因此又稱為胞嘧啶甲基化作用。該過程的皮生是由一類稱為甲基化轉移酶(DNA methyltransferase,Dnmt)的高度保守的酶所介導的。已有的大量研究證明,由甲基化轉移酶所介導的DNA甲基化作用在真核生物正常的細胞分化、生長發(fā)育、表型變化以及其他重要的代謝過程中起到舉足輕重的作用。因此,通過對生物中催化甲基化產(chǎn)生的甲基化作用機制系統(tǒng)進行詳細了解,可以進一步明確DNA甲基化對發(fā)育及代謝調控的作用。二斑葉螨(Tetranychus urticae Koch)是一種世界性的農業(yè)害螨,能夠危害多達1,100多種植物。如今,它以其發(fā)育歷期短、易于飼養(yǎng)等獨特的優(yōu)點逐漸被應用于實驗室內的遺傳學研究。雖然二斑葉螨的發(fā)育歷期較短,但是卻具有較為復雜的發(fā)育可塑性。此外,二斑葉螨中具有單、雙倍體決定性別的機制,受精卵發(fā)育成為雌性個體,而未受精卵的則發(fā)育成為雄性個體。發(fā)育成熟后的雌螨個體存在著典型的性二型現(xiàn)象。更有意思地是,在自然界中,二斑葉螨通常會以兩種色型存在:一種是體色為黃綠色的綠色型;另一種則體色為洋紅色的紅色型,又稱為朱砂葉螨[T.cinnabarinus(Boisduval)]。越來越多的證據(jù)支持這兩種色型擁有相似的遺傳背景,即可能是一個種有兩個表現(xiàn)型的現(xiàn)象。而這種現(xiàn)象的產(chǎn)生很有可能是DNA甲基化作用所造成的。鑒于大量針對DNA甲基化調控表型變化的研究成果,DNA甲基化的這種調控作用是否會在二斑葉螨的個體發(fā)育以及兩種色型形成的過程也得到延續(xù),是值得探究的一個問題。為了解決以上的科學問題,本研究首次利用RACE技術對二斑葉螨中甲基化轉移酶3基因(Tudnmt3)進行克隆,并利用生物信息學手段分析該基因的初級、二級以及三級結構。結果顯示,Tudnmt3具有從頭甲基化活性所必需的3個保守結構域(PWWP結構域、鋅指結構域和催化活性結構域)與6個高度保守的模體。并且,二級與三級蛋白結構的預測結果同樣反映出它與數(shù)據(jù)庫中已知的甲基化轉移酶3具有高度的保守性,且擁有與甲基化轉移酶3構象的激活和穩(wěn)定所必需的氨基酸殘基。綜上所述,一系列的生物信息學分析反映出Tudnmt3的確是屬于從頭甲基化轉移酶3家族,結構更傾向于甲基化轉移酶3a,推斷Tudnmt3在二斑葉螨中是具有活性的,并且可能起到重要的從頭甲基化作用。既然Tudnmt3基因具備著從頭甲基化轉移酶3家族所必需要的活性模體,也就說明它可能在二斑葉螨的個體的生長發(fā)育甚至基本代謝過程中起到重要的調控作用。因此,本研究中對二斑葉螨中的甲基化轉移酶3可能起到的功能作用進行了初步的探究。熒光定量PCR的結果顯示Tudnmt3在二斑葉螨的整個生活史中具普遍表達。但是,在雌雄不同性別的發(fā)育歷期中表達模式并不相同。整體原位雜交的實驗結果為Tudnmt3可能與雌雄成螨的性腺發(fā)育分化有關提供了有利的證據(jù)。后續(xù)的MSAP(methylation-sensitive amplification polymorphism)技術所獲得的119個位點進行分析,表明了雌雄成螨的甲基化模式的略微不同,這樣的結果暗示了雌雄成螨中DNA甲基化模式的不同可能是Tudnmt3的不同的甲基化活性所引起的。為了更好地闡述甲基化轉移酶3在二斑葉螨雌雄成螨中的功能,本研究對雌雄葉螨中甲基化轉移酶3蛋白的表達量,以及其在體內的定位進行了一系列的分析。蛋白印記的結果顯示這個蛋白在兩種性別中均有表達,但在雌成螨中顯著高于雄成螨,這是與先前研究中該基因的轉錄水平的趨勢是不一致的,可能暗示了該基因發(fā)生了翻譯后修飾。后續(xù)的免疫熒光檢測結果進一步證明了甲基化轉移酶3在雌成螨中的表達量高于雄成螨,并且發(fā)現(xiàn)甲基化轉移酶3是定位于細胞質中,且主要在葉螨的生殖區(qū)域表達,支持了先前的假設:在二斑葉螨中由甲基化轉移酶3所介導的從頭甲基化作用可能在性腺發(fā)育或者配子的形成有關,并且作用機制是不同于維持型甲基化轉移酶的。先前的一系列研究證明了在二斑葉螨的個體發(fā)育過程中,從頭甲基化轉移酶所介導的DNA甲基化作用起到了一定的調控作用�；诂F(xiàn)有的證據(jù)證明甲基化轉移酶與社會型昆蟲的級型變化有關,這個基因是否會在二斑葉螨兩種色型的發(fā)育過程也發(fā)揮重要作用,尤其是否與體色分化有關,是值得研究的。本研究主要利用熒光定量PCR技術檢測了Tudnmt3在二斑葉螨紅色型(TuR)與綠色型(TuG)不同發(fā)育時期中的表達水平。結果顯示,Tudnmt3基因在中國二斑葉螨兩種色型的各個發(fā)育時期均具普遍表達,并且在發(fā)育過程中具有相似的表達趨勢,隨著齡期的增長,表達量逐漸下降。其中,卵的發(fā)育時期是表達量最高的,統(tǒng)計分析顯示顯著高于成螨階段(P0.05)。從不同表型對應的相同階段的分析,發(fā)現(xiàn)Tudnmt3基因的表達量是存在差異但只有在成螨階段中的表達量達到統(tǒng)計意義,暗示了Tudnmt3基因所介導的從頭甲基化作用在二斑葉螨兩種色型的發(fā)育形成中可能發(fā)揮著一些作用。雖然從頭甲基化作用可能在二斑葉螨的紅、綠色型的體色形成過程中具有作用,但具體是否能夠調控某些與色素合成相關的基因表達從而引起紅、綠色型體色變化是未知的。因此,為了解決這一重要問題,我們利用轉錄組測序技術尋找兩種表型之間與色素合成相關的差異表達基因,初步揭示可能引起兩種色型變化的基因表達的分子機制。轉錄組測序的結果發(fā)現(xiàn)兩種色型共有的與色素合成相關的基因有83個,其中11個是具有顯著性差異表達的(FDR0.05)。其次,利用定量PCR技術檢測10個基因在兩種色型的體色的不同階段的表達量,結果發(fā)現(xiàn)大多數(shù)基因在紅色型中維持著高的表達量。同時,對犬尿氨酸3-羥化酶基因和絲氨酸蛋白酶抑制劑27A基因進行亞硫酸氫鹽法測序發(fā)現(xiàn),在紅、綠色型體色的不同階段之間存在著甲基化水平的差異,但統(tǒng)計分析并不顯著(P0.05)。最后,對紅色型的成螨進行去甲基化抑制處理發(fā)現(xiàn),犬尿氨酸3-羥化酶基因和絲氨酸蛋白酶抑制劑27A基因的表達量均出現(xiàn)了極顯著下調(P0.001),直接證明了 DNA甲基化對色素基因的表達具有直接的影響。與期望不符地是,低甲基化水平并未對紅色型的體色以及其他生理指標產(chǎn)生影響。
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【學位授予單位】：南京農業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：S433.7

【參考文獻】

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