本文關(guān)鍵詞： 灰飛虱 RNA干擾 AGO亞家族 PIWI亞家族 qRT-PCR　出處：《浙江師范大學(xué)》2015年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：Argonaute蛋白是RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體(RNA induced silencing complex, RISC)中的核心組分,通過與非編碼小RNA (micRNA, siRNA, piRNA)結(jié)合而發(fā)揮重要作用,在真核生物中分為AGO亞家族和PIWI亞家族。AGO亞家族廣泛分布在多種組織器官中,通過結(jié)合由RNase Ⅲ核酸內(nèi)切酶加工處理得到的siRNA、 miRNA參與到siRNA和miRNA途徑而發(fā)揮作用；PIWI亞家族通過結(jié)合piRNA在動物生殖細(xì)胞發(fā)育和配子生成過程中發(fā)揮重要作用。雖然一些昆蟲中的AGO家族基因早已明確,如褐飛虱(Nilaparvata lugens),家蠶(Bombyx mori),斯氏按蚊(Anopheles stephensi),但大部分昆蟲的AGO蛋白還尚不清楚�；绎w虱(Laodelphax striatellus)是一種普遍存在的經(jīng)濟(jì)害蟲,屬于飛虱科、半翅目,主要傳播水稻條紋病毒(Rice stripe virus, RSV)口水稻黑條矮縮病毒(Rice black-streaked dwarf virus, RBSDV),對我國的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成嚴(yán)重危害。本研究通過生物信息學(xué)、RACE等技術(shù),對灰飛虱AGO亞家族和PIWI亞家族成員進(jìn)行了鑒定、克隆,并對其在不同發(fā)育階段及不同條件下的情況進(jìn)行了分析研究。1.灰飛虱中AGO家族蛋白的鑒定與克隆通過將灰飛虱的轉(zhuǎn)錄組與褐飛虱、果蠅、家蠶的AGO蛋白序列進(jìn)行比對分析,得到灰飛虱AGO亞家族(AGO1, AGO2)和PIWI亞家族(PIWI, AGO3)的EST序列。采用5'RACE和3'RACE技術(shù)克隆得到了這四個亞家族成員的ORF序列,分析表明,灰飛虱AGO1的ORF核苷酸序列全長2,820 bp,編碼939個氨基酸殘基；灰飛虱AG02的ORF核昔酸全長2,490 bp,編碼829個氨基酸殘基；灰飛虱PIWI的ORF核苷酸全長2,508 bp,編碼835個氨基酸殘基；灰飛虱AG03的ORF核苷酸全長2,688 bp,編碼895個氨基酸殘基。在灰飛虱的AGO和PIWI亞家族中都發(fā)現(xiàn)了預(yù)期的保守PAZ和PIWI功能域,且PIWI功能域中都含有DDH催化活性位點(diǎn)。將灰飛虱AGO1、AGO2、PIWI、AGO3的PIWI功能域與其它種昆蟲的PIWI功能域進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析,結(jié)果表明AGO和PIWI亞家族分別聚類成兩個不同的分枝。2.不同環(huán)境壓力和不同發(fā)育階段,灰飛虱AGO家族的表達(dá)譜分析為了對AGO和PIWI亞家族的潛在功能進(jìn)行初步研究,本研究在轉(zhuǎn)錄水平上對灰飛虱不同發(fā)育階段和不同環(huán)境壓力下AGO1、AGO2、PIWI和AG03的mRNA表達(dá)譜進(jìn)行了分析。這四種AGO蛋白在各個發(fā)育階段都有表達(dá),AGO1和AG02的mRNA表達(dá)量在卵中最高,其次是成蟲、高齡若蟲、低齡若蟲,表明AGO亞家族蛋白可能在卵母細(xì)胞的成熟和發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用；PIWI和AG03的mRNA表達(dá)量在雄性灰飛虱中高于雌性灰飛虱,表明PIWI亞家族蛋白可能對雄性生殖細(xì)胞及精子的發(fā)生起著更重要的作用。有趣的是,當(dāng)灰飛虱成蟲感染RBSDV以后,AGO1和AG02的表達(dá)都呈現(xiàn)出明顯的下調(diào)趨勢,推測灰飛虱的成蟲期可能是RBSDV侵染的后期階段,灰飛虱細(xì)胞中的抗病毒機(jī)制在此階段可能對RBSDV的病毒量有較顯著的抑制作用。高低溫及轉(zhuǎn)移寄主后,灰飛虱體內(nèi)AGO表達(dá)下調(diào),表明AGO和PIWI亞家族可能參與適應(yīng)環(huán)境壓力的生物調(diào)控。3.灰飛虱AGO亞家族成員AGO1和AG02的多克隆抗體制備通過抗原設(shè)計(jì)及基因序列合成制備多克隆抗體的免疫原,免疫家兔后,采用硫酸銨沉淀和Protein A柱層析分離純化所獲得的抗體,最后經(jīng)ELISA和Western blot檢測后得到高效的AGO抗體。本研究首次克隆和分析了灰飛虱的AGO亞家族和PIWI亞家族,對不同環(huán)境壓力及不同發(fā)育階段的表達(dá)譜分析結(jié)果表明sRNA介導(dǎo)的RNAi途徑參與到了這些調(diào)控過程中,這為以后進(jìn)一步探索灰飛虱AGO的具體功能提供了重要線索。另外,制備的灰飛虱AGO1和AG02多克隆抗體有助于后續(xù)進(jìn)一步深入研究灰飛虱中RNAi為基礎(chǔ)的抗病毒機(jī)制。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：浙江師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S433.3

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：1525746