本文關(guān)鍵詞：葡萄糖氧化酶GOX在棉鈴蟲與煙青蟲下唇腺差異表達的機理初探

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【摘要】：同屬鱗翅目、夜蛾科、鈴夜蛾屬的棉鈴蟲Helicoverpa armigera和煙青蟲H.assulta是兩個近緣種,但是二者取食的寄主范圍卻存在很大差異。棉鈴蟲是典型的多食性昆蟲,可以取食30多個科200多種植物;而煙青蟲是寡食性昆蟲,只能取食茄科的少數(shù)植物,如煙草和辣椒等。為了深入揭示植食性昆蟲食性差異的內(nèi)在機理,本文選取二近緣種棉鈴蟲和煙青蟲為研究材料,以在植食性昆蟲與寄主互作中發(fā)揮重要作用的昆蟲下唇腺葡萄糖氧化酶(glucose oxidase,GOX)為研究對象,比較了二近緣種GOX在轉(zhuǎn)錄和蛋白水平的表達差異,并對其進行分析和探究,取得以下結(jié)果。一、棉鈴蟲與煙青蟲下唇腺轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析轉(zhuǎn)錄組RNA-seq為深度揭示基因組規(guī)模的轉(zhuǎn)錄模式提供了極大的便利。為了從宏觀的角度比較多食性的棉鈴蟲與寡食性煙青蟲在食性上的巨大差異,首先對二近緣種的下唇腺進行轉(zhuǎn)錄組測序,對其轉(zhuǎn)錄水平表達進行系統(tǒng)比較,并以棉鈴蟲和煙青蟲末齡幼蟲下唇腺轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)為背景,鎖定了目標基因GOX。結(jié)果表明棉鈴蟲和煙青蟲GOX基因的RPKM值分別是5020.8和4503.5。二者轉(zhuǎn)錄水平差異不顯著。二、二近緣種GOX活性的動態(tài)變化棉鈴蟲下唇腺由四部分組成,分別是吐絲部、前部、中部及后部,屬N型。幼蟲期隨蟲齡的增大,下唇腺隨之發(fā)育變大。與之相應(yīng),GOX活性在不同蟲齡甚至是同一蟲齡的不同時期亦發(fā)生相應(yīng)的變化。為了明確棉鈴蟲和煙青蟲末齡幼蟲在不同時期的GOX活性變化,從蛻皮進入末齡開始,每隔12 h為一個時間點,一直到蛻皮后72 h,分別測定了其GOX活性的變化,以及同期幼蟲相對生長率。結(jié)果表明:棉鈴蟲和煙青蟲一樣,均是在脫皮后12 h GOX活性達到最高值,此時,棉鈴蟲的酶活是煙青蟲的7.3倍,差異達極顯著(p0.01)。棉鈴蟲在48 h以后,GOX活性開始下降,而煙青蟲卻是在60 h以后。二者均在蛻皮進入末齡幼蟲初始和預(yù)蛹時活性最低。與此同時,在GOX活性最高時,二者的相對生長率最大,也即取食最活躍的時期。由此可見,GOX活性與昆蟲的取食密切相關(guān)。三、食物因子對二近緣種下唇腺GOX基因轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控不同昆蟲的GOX活性存在極大差異,鑒于GOX與食性的密切關(guān)系,分別讓二近緣種取食不同食物,比較不同食物刺激下,如寄主植物,不同營養(yǎng)物質(zhì)(p:c),或植物毒素對GOX基因轉(zhuǎn)錄水平的變化,并與下文中GOX活性的變化相對應(yīng),探索引起GOX變化的主要因素,明確它的變化是轉(zhuǎn)錄水平上的調(diào)控還是翻譯或翻譯后的調(diào)控。結(jié)果表明:取食不同寄主植物后,多食性的棉鈴蟲GOX基因會被其不適宜寄主辣椒誘導(dǎo)而高表達,達顯著水平。而對寡食性的煙青蟲而言,無論是棉花、煙草還是辣椒都顯著誘導(dǎo)GOX基因的高表達。在取食了不同蛋白質(zhì)和糖比例(p:c)的人工飼料后,棉鈴蟲的GOX基因表達量僅在50 p:50c時與對照存在顯著差異;而煙青蟲的卻總是隨著糖濃度的升高而升高,且在糖濃度最高時與對照存在顯著差異。在取食添加了不同植物毒素的人工飼料后,棉鈴蟲GOX基因無明顯的變化;而煙青蟲在取食添加了黃酮、十三烷酮、花椒毒素和香豆素的飼料后,其GOX基因被誘導(dǎo)高表達,且顯著高于對照。由此表明,寡食性煙青蟲的GOX基因?qū)Σ煌闹髦参铩I養(yǎng)物質(zhì)和毒素的敏感性要高于多食性棉鈴蟲。四、食物因子對二近緣種GOX活性的影響在明確了食物因子對二近緣種GOX基因轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控的基礎(chǔ)上,進一步,研究其對二近緣種GOX活性的影響。研究表明:三種植物對兩個物種GOX的影響有所不同,但是都表現(xiàn)為取食相對不適宜的寄主植物具有較高的活性。已有的研究尚未就植物中營養(yǎng)物質(zhì)和植物毒素對GOX的影響進行揭示。盡管不同蛋白質(zhì)和糖比例(p:c)的飼料對兩種昆蟲的GOX活性沒有顯著影響,但是可以看出棉鈴蟲的GOX活性是隨著糖濃度的升高而升高的。進一步,比較了兩物種取食分別添加12種植物毒素的人工飼料后的GOX活性變化。結(jié)果表明,二近緣種表現(xiàn)出了不同的反應(yīng),煙青蟲對黃酮、香豆素和花椒毒素的敏感性要高于棉鈴蟲,對棉酚和煙堿有更好的耐受性。在所有的試驗中,多食性的棉鈴蟲的活性都要顯著高于寡食性的煙青蟲。在應(yīng)對植物次生代謝物質(zhì)的策略上,棉鈴蟲的GOX可能是作為一種組成型的蛋白存在,而煙青蟲的可能是一種誘導(dǎo)性蛋白,究竟這是一種怎樣的調(diào)節(jié)機制,仍需做進一步的研究。
【關(guān)鍵詞】：葡萄糖氧化酶GOX 下唇腺 近緣種 動態(tài)變化 轉(zhuǎn)錄 酶活性 寄主植物 營養(yǎng)物質(zhì) 植物毒素
【學(xué)位授予單位】：河南農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S433
【目錄】：

• 致謝4-8
• 摘要8-10
• 1 文獻綜述10-18
• 1.1 植食性昆蟲下唇腺葡萄糖氧化酶的基本特性10-14
• 1.1.1 GOX在昆蟲中的分布10-12
• 1.1.2 GOX的理化特性12-13
• 1.1.3 昆蟲不同發(fā)育階段GOX活性的變化13
• 1.1.4 GOX在昆蟲各個組織中的分布13-14
• 1.2 GOX與植物防御之間的關(guān)系14-15
• 1.2.1 GOX抑制寄主植物防御性物質(zhì)的含量14
• 1.2.2 GOX誘導(dǎo)寄主植物的直接性防御和間接性防御14-15
• 1.3 不同寄主植物和食物因子對GOX的影響15-18
• 1.3.1 不同的寄主植物對GOX的影響15-16
• 1.3.2 營養(yǎng)物質(zhì)中糖與蛋白質(zhì)對GOX的影響16-17
• 1.3.3 植物毒素與昆蟲幼蟲下唇腺GOX的關(guān)系17-18
• 2 引言18-20
• 2.1 研究背景18-19
• 2.2 目的與意義19-20
• 3 棉鈴蟲與煙青蟲幼蟲下唇腺轉(zhuǎn)錄組比較20-23
• 3.1 材料與方法20-21
• 3.1.1 供試昆蟲20
• 3.1.2 下唇腺的收集及RNA的提取20
• 3.1.3 數(shù)據(jù)組裝20
• 3.1.4 Rpeat Masking20-21
• 3.1.5 數(shù)據(jù)過濾21
• 3.1.6 序列比對21
• 3.2 結(jié)果與分析21-23
• 3.2.1 數(shù)據(jù)過濾結(jié)果21-22
• 3.2.2 Ortholog Pair識別22
• 3.2.3 表達量計算22-23
• 4 二近緣種GOX活性動態(tài)變化23-29
• 4.1 材料與方法23-25
• 4.1.1 供試昆蟲23
• 4.1.2 酶與試劑23
• 4.1.3 幼蟲相對生長率23
• 4.1.4 下唇腺提取物的收集23
• 4.1.5 GOX酶活性的測定23-24
• 4.1.6 溶液與凝膠的配制24-25
• 4.1.7 統(tǒng)計分析25
• 4.2 結(jié)果與分析25-29
• 4.2.1 棉鈴蟲下唇腺顯微形態(tài)25-27
• 4.2.2 二近緣種末齡幼蟲GOX活性的動態(tài)變化27-28
• 4.2.3 二近緣種末齡幼蟲的相對生長率28-29
• 5 食物因子對二近緣種下唇腺GOX基因轉(zhuǎn)錄水平表達的影響29-34
• 5.1 材料與方法29-31
• 5.1.1 供試昆蟲與植物29
• 5.1.2 不同食物對昆蟲的處理29
• 5.1.3 下唇腺提取物的收集及RNA的提取29
• 5.1.4 cDNA的獲取29-30
• 5.1.5 實時熒光定量PCR分析30
• 5.1.6 統(tǒng)計分析30-31
• 5.2 結(jié)果與分析31-34
• 5.2.1 寄主植物對二近緣種GOX基因的轉(zhuǎn)錄水平的影響31-32
• 5.2.2 不同蛋白質(zhì)與糖比例對二近緣種GOX基因轉(zhuǎn)錄水平的影響32-33
• 5.2.3 植物毒素對二近緣種GOX基因轉(zhuǎn)錄水平的影響33-34
• 6 食物因子對二近緣種下唇腺GOX酶活性的影響34-38
• 6.1 材料與方法34
• 6.1.1 供試昆蟲與植物34
• 6.1.2 酶和試劑34
• 6.1.3 食料與昆蟲的不同處理34
• 6.1.4 下唇腺提取物的收集34
• 6.1.5 GOX活性的測定34
• 6.1.6 溶液和凝膠的配制34
• 6.1.7 統(tǒng)計分析34
• 6.2 結(jié)果與分析34-38
• 6.2.1 取食不同植物對GOX活性的影響34-35
• 6.2.2 不同比例的蛋白質(zhì)和糖（p:c）處理后幼蟲下唇腺GOX活性的變化35-37
• 6.2.3 毒素處理對GOX活性的影響37-38
• 7 結(jié)論與討論38-42
• 7.1 棉鈴蟲與煙青蟲幼蟲下唇腺轉(zhuǎn)錄組分析38
• 7.2 二近緣種GOX活性的動態(tài)變化基本一致38
• 7.3 食物因子對二近緣種下唇腺GOX基因轉(zhuǎn)錄水平表達的影響不同38-39
• 7.3.1 非適宜性寄主誘導(dǎo)棉鈴蟲GOX基因的高表達38-39
• 7.3.2 蛋白質(zhì)和糖均能影響二近緣種GOX基因的表達39
• 7.3.3 煙青蟲應(yīng)對植物毒素的策略屬誘導(dǎo)型39
• 7.4 食物因子對于二近緣種下唇腺GOX酶活性的影響不同39-42
• 7.4.1 取食不同的寄主植物對GOX活性的誘導(dǎo)39
• 7.4.2 棉鈴蟲GOX酶活性隨著糖濃度的增加而增加39-40
• 7.4.3 植物毒素處理對GOX活性的影響不同40-42
• 參考文獻42-47
• ABSTRACT47-49

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本文編號：1020833