【摘要】：干旱、鹽、極端溫度等非生物脅迫嚴(yán)重影響植物的生長(zhǎng)和發(fā)育。植物在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中形成了復(fù)雜而精準(zhǔn)的信號(hào)網(wǎng)絡(luò),可以感知外界信號(hào)并做出響應(yīng)。在非生物脅迫下,植物可以調(diào)控脅迫相關(guān)基因的表達(dá),從而提高植物的抗性。探究植物脅迫響應(yīng)機(jī)制對(duì)于提高植物抗性具有十分重要的作用。植物泛素連接酶參與了多種信號(hào)傳導(dǎo)途徑。SEVEN IN ABSENTIA(SINA)首次在果蠅中被發(fā)現(xiàn),參與果蠅眼睛的形成。SINA是一類含有RING保守域的泛素連接酶,RING保守域?qū)τ赟INA的泛素連接酶活性具有決定性作用。擬南芥中共發(fā)現(xiàn)18個(gè)SINA-like蛋白,其中SINA2不含有該家族其它成員共有的RING保守域。本研究以擬南芥為研究材料,探究SINA2在非生物脅迫條件下的響應(yīng);通過(guò)原核表達(dá)系統(tǒng)獲得His-SINA2融合蛋白,該蛋白在體外具有泛素連接酶活性;通過(guò)酵母雙雜交系統(tǒng)篩庫(kù),獲得SINA2的互作蛋白CDKG1,進(jìn)一步研究SINA2與CDKG1之間的關(guān)系;分析CDKG1在非生物脅迫下的響應(yīng)及其功能;研究同時(shí)克隆了小麥SINA同源基因TaSINA1,分析其進(jìn)化關(guān)系及表達(dá)特性。主要得到以下結(jié)果:1、氨基酸序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)SINA2在N端缺失RING保守域,而含有一個(gè)不完全保守的B-box2保守域;進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)SINA2與其它SINA蛋白的親緣關(guān)系較遠(yuǎn),其通過(guò)原核表達(dá)系統(tǒng)獲得His-SINA2融合蛋白;His-SINA2在體外可以催化自身泛素化,對(duì)于UbcH5a具有特異性。2、SINA2定位在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中;在各個(gè)器官中均有表達(dá),在花和果莢中的轉(zhuǎn)錄水平最高;SINA2在干旱、鹽脅迫和ABA處理下的轉(zhuǎn)錄水平均有提高;sina2突變體對(duì)干旱、鹽脅迫和ABA處理十分敏感,發(fā)芽率和子葉展開率均明顯低于野生型。3、通過(guò)酵母雙雜交篩庫(kù)獲得SINA2的互作蛋白CDKG1;通過(guò)原核表達(dá)系統(tǒng)獲得MBP-CDKG1,在體外SINA2可以與MBP-CDKG1結(jié)合;將表達(dá)YFPN-SINA2和YFPC-CDKG1融合蛋白的載體通過(guò)農(nóng)桿菌注射法轉(zhuǎn)化煙草葉片表皮細(xì)胞,在細(xì)胞核中發(fā)現(xiàn)黃色熒光信號(hào)。4、CDKG1具有磷酸化活性,在體外可磷酸化SINA2;重組蛋白His-SINA2在原核表達(dá)過(guò)程中已被磷酸化,λ蛋白磷酸酶可以去除SINA2的磷酸化,而CDKG1可以恢復(fù)SINA2的磷酸化水平;CDKG1磷酸化SINA2增強(qiáng)其泛素連接酶活性;去磷酸化的SINA2失去泛素連接酶活性,CDKG1磷酸化去磷酸化的SINA2可以恢復(fù)其活性。5、CDKG1含有一個(gè)保守Ser/Thr蛋白激酶保守域,與其它物種CDKG1具有較近的親緣關(guān)系,定位于細(xì)胞核中;CDKG1在擬南芥幼苗以及根、莖、葉、花和果實(shí)中均有表達(dá),在花和果莢的表達(dá)量最高;CDKG1受干旱、鹽脅迫和ABA處理誘導(dǎo)表達(dá);CDKG1過(guò)表達(dá)植株在干旱、鹽脅迫和ABA處理下的發(fā)芽率和子葉展開率明顯高于野生型,而cdkg1突變體對(duì)于脅迫十分敏感,其發(fā)芽率和子葉展開率低于野生型;脅迫相關(guān)基因在不同株系中的表達(dá)發(fā)生了改變。6、比對(duì)發(fā)現(xiàn)小麥三個(gè)SINA同源基因,分別命名為TaSINA1、TaSINA2和TaSINA3。氨基酸序列分析表明小麥三個(gè)SINA蛋白N端含有保守的RING保守域;其中TaSINA1定位在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中,且該基因受干旱、鹽脅迫和ABA處理誘導(dǎo)表達(dá)。
【圖文】：

第一章 文獻(xiàn)綜述 第一章 文獻(xiàn)綜述1.1 泛素-蛋白酶體途徑的組成泛素-蛋白酶體途徑（UPS）是真核生物調(diào)控蛋白降解和功能的重要系統(tǒng)。該系統(tǒng)是靶蛋白與多個(gè)泛素分子共價(jià)結(jié)合，形成靶蛋白多聚泛素鏈，被 26S 蛋白酶體識(shí)別并降解的過(guò)程。泛素-蛋白酶體途徑由泛素 Ub、泛素激活酶 E1、泛素結(jié)合酶 E2、泛素連接酶E3 和 26S 蛋白酶體組成，其對(duì)靶蛋白的降解是一個(gè)三酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)的過(guò)程（如圖 1-1）。

所有的泛素結(jié)合酶具有的共同特點(diǎn)是把激活的泛素傳遞給不同的泛素連接酶。酵母和動(dòng)物的泛素結(jié)合酶還具有不同的功能，包括調(diào)控細(xì)胞周期、DNA 修復(fù)以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)移位蛋白的降解（Pickart, 2001）。序列分析比對(duì)，擬南芥泛素結(jié)合酶分為 12 個(gè)亞族（Vierstra, 1996）。根據(jù)共表達(dá)和互作數(shù)據(jù)，不同的泛素結(jié)合酶會(huì)選擇不同的泛素結(jié)合酶互作。AtUBC8 能與大多數(shù)泛素連接酶互作，而 AtUBC34 只與特殊的泛素連接酶互作。泛素結(jié)合酶變體雖然在序列和結(jié)構(gòu)上與泛素結(jié)合酶十分相似，但是缺失具有催化活性的半胱氨酸位點(diǎn)，因此不能與泛素形成硫酯鍵。進(jìn)化樹分析顯示擬南芥含有的 8 個(gè)泛素結(jié)合酶變體共分為 3 個(gè)亞族（Zhang et al., 2007）。1.1.4 泛素連接酶 E3泛素連接酶的催化作用是泛素化過(guò)程中酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)中的最后一步。泛素連接酶可以與特定的泛素結(jié)合酶和靶蛋白結(jié)合，因此該酶是決定靶蛋白的多樣性與特異性。在植物界，，泛素連接酶根據(jù)其反應(yīng)機(jī)理以及特殊的保守域，共分為三種：HECT（Homology toE6-Associated Carboxy-Terminus）泛素連接酶、RING（Really Interesting New Gene）泛素連接酶和 U-box 泛素連接酶（Duplan and Rivas, 2014）（如圖 1-2）。
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S512.1

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2661396