【摘要】：香蕉枯萎病是由尖孢鐮刀菌古巴�；�(Fusarium oxysporum f.sp.cubense)引起的維管束系統(tǒng)性病害,對香蕉生產(chǎn)造成毀滅性的破壞,引起巨大的經(jīng)濟(jì)損失。香蕉枯萎病菌1號小種(Foc1)廣泛分布于世界各地,主要侵染粉蕉(Musa AAB);香蕉枯萎病菌4號小種(Foc4)幾乎能感染所有的香蕉品種,為害最嚴(yán)重。尖孢鐮刀菌在與寄主相互作用時會產(chǎn)生一些與致病性密切相關(guān)細(xì)胞壁降解酶(Cell wall degrading enzymes,CWDEs),降解寄主的細(xì)胞壁防御和保護(hù)組織,其中,果膠酶在致病過程中起著重要作用。在本研究室已獲得3種碳源誘導(dǎo)條件下香蕉枯萎病菌2個小種轉(zhuǎn)錄組差異分析結(jié)果的基礎(chǔ)上,將轉(zhuǎn)錄組結(jié)果中功能注釋為果膠甲酯酶基因的comp12226_c0、comp14619_c0在進(jìn)行BLAST比對,表明均屬于Pectinesterase家族基因,與串珠鐮刀菌(Fusarium moniliforme)同源性為92%、93%,分別命名為pme1和pme2。轉(zhuǎn)錄組結(jié)果分析顯示pme1和pme2基因在2小種表達(dá)量差異較明顯,且在Foc4中的表達(dá)量均高于Foc1。通過Quantitative Real-time PCR驗證,pme1在Foc4的表達(dá)量是Foc1的300-500倍,pme2在Foc4的表達(dá)量是Foc1的100-700倍,qPCR結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果相符�；蚩寺y序顯示:Foc1-pme1和Foc4-pme1 DNA序列均為1141 bp,編碼區(qū)均為990 bp,編碼區(qū)同源性為98.7%,均為2個內(nèi)含子和3個外顯子組成。Foc1-pme2和Foc4-pme2 DNA序列均為1321 bp,編碼區(qū)均為1221 bp,編碼區(qū)同源性為98.5%,均為2個內(nèi)含子和3個外顯子組成。pme1和pme2編碼蛋白屬于Pectinesterase家族蛋白,均定位于細(xì)胞外,pme1保守區(qū)域為26-315aa,pme2保守區(qū)域為57-381aa,氨基酸功能位點均為IQGATDFIFG,均有糖基化位點和磷酸化位點。PME1、PME2同工酶基因轉(zhuǎn)化到酵母Pichia pastoris GS115中進(jìn)行真核表達(dá)。以1%甲醇誘導(dǎo)目的基因表達(dá),收集上清液,通過SDS-PAGE分析。結(jié)果表明:目的基因在24 h已經(jīng)開始表達(dá),通過western blot再次驗證目的基因表達(dá)。連續(xù)分光光度計法和瓊脂糖擴散法測定粗蛋白酶活,結(jié)果表明重組蛋白可以降解高度酯化的果膠,在果膠培養(yǎng)基中可檢測到水解圈,表明獲得具有活性的重組蛋白。利用hiTAIL-PCR獲得目的基因上下游同源臂,通過同源重組的方法構(gòu)建了Foc1-pme1、Foc4-pme1、Foc1-pme2和Foc4-pme2基因敲除載體,利用ATMT方法進(jìn)行轉(zhuǎn)化,成功獲得基因缺失突變體。采用浸根接種的方法,將敲除突變體接種寄主,觀察記錄結(jié)果45 d,敲除突變體和野生菌株接種的寄主都出現(xiàn)典型的香蕉枯萎病癥狀。雖然突變體的病情指數(shù)與對應(yīng)的野生型相比有所降低,但統(tǒng)計分析表明,突變體與野生型之間的病情指數(shù)沒有顯著差異,說明敲除單個PME基因?qū)oc1和Foc4的致病力影響不大,PME基因不是Foc1和Foc4侵染寄主的關(guān)鍵致病因子,但與病害的嚴(yán)重度可能有一定的關(guān)系。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：華南農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S436.68

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 蔡飛燕;;研究人員成功研發(fā)香蕉無性系[J];世界熱帶農(nóng)業(yè)信息;2014年02期

2 李斌;盛鷗;李春雨;魏岳榮;左存武;胡春華;易干軍;羅充;;香蕉枯萎病病原菌的研究進(jìn)展[J];分子植物育種;2013年05期

3 黃穗萍;莫賤友;郭堂勛;李其利;潘朝勃;;廣西香蕉枯萎病4號生理小種發(fā)生情況及香蕉品種抗性鑒定[J];南方農(nóng)業(yè)學(xué)報;2013年05期

4 吳劍飛;王海民;;中國香蕉產(chǎn)業(yè)發(fā)展現(xiàn)狀及競爭力分析[J];現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技;2013年07期

5 許林兵;;2013年到了,香蕉滅亡了嗎?[J];中國熱帶農(nóng)業(yè);2013年02期

6 王璇;邢繼紅;趙斌;韓建民;董金皋;;灰葡萄孢分生孢子產(chǎn)生相關(guān)基因的克隆及功能分析[J];微生物學(xué)通報;2013年03期

7 孫華;王春燕;宋楊;吳樹敬;張芮;馮守千;陳曉流;陳學(xué)森;;新疆紅肉蘋果PGIP基因的克隆及原核表達(dá)[J];果樹學(xué)報;2013年01期

8 董章勇;王振中;;香蕉枯萎病菌果膠甲基酯酶基因的克隆與生物信息學(xué)分析[J];生物技術(shù)通報;2012年06期

9 黃穗萍;莫賤友;郭堂勛;胡鳳云;;香蕉枯萎病防治技術(shù)研究進(jìn)展[J];中國熱帶農(nóng)業(yè);2011年05期

10 盧娟;夏啟玉;孫建波;盧雪華;王宇光;張昕;;一株拮抗香蕉枯萎病菌的鏈霉菌分離和鑒定[J];熱帶作物學(xué)報;2011年02期

，

本文編號：2473248