發(fā)布時間：2017-08-24 01:17

  本文關(guān)鍵詞：功能化石墨烯的制備及其細胞毒性和基因轉(zhuǎn)染研究

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【摘要】：石墨烯大的比表面積以及芳香共軛結(jié)構(gòu)等特點,為基因或其他化學藥物的負載提供了條件。但是,未經(jīng)處理的石墨烯具有在水溶液中分散性差和易發(fā)生團聚等缺點,導致其應(yīng)用受到了限制,尤其在生命科學領(lǐng)域。通過合適的方法對石墨烯進行修飾,增大其分散性以及生物相容性,充分拓展石墨烯在生命科學領(lǐng)域的應(yīng)用是目前研究的重點。本文采用混酸(濃H2SO4和濃HNO3,V/V=3:1)氧化處理石墨烯得到氧化石墨烯;并分析了氧納米材料化石墨烯-殼聚糖-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸三肽納米粒子雜化物(GO-CHIT-RGD NPs)對黑色素瘤細胞(A375)產(chǎn)生較大毒性的原因。且結(jié)合精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸三肽(Arg-Gly-Asp三肽,RGD)、間氨基苯硼酸(3-Aminophenylboronic acid,ABA)、4-氨基苯-β-D-半乳糖苷(4-aminophenylβ-D-Galactopyranoside,GAL)、聚酰胺-胺(PAMAM)和葡萄糖酸(Gluconic acid,GA)的特點,利用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC HCl)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)偶聯(lián)的方法合成了氧化石墨烯-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸三肽雜化物(GO-RGD)、氧化石墨烯-間氨基苯硼酸(GO-ABA)、氧化石墨烯-半乳糖(GO-GAL)和氧化石墨烯-聚酰胺-胺-葡萄糖酸(GO-PAMAM-GA)復(fù)合物。評價了GO-RGD、GO-ABA和GO-GAL復(fù)合材料對不同細胞的體外細胞毒性,并初步分析了其對不同細胞系產(chǎn)生選擇性細胞毒性的原因。評價了GO-PAMAM-GA復(fù)合材料作為基因載體對不同細胞系的細胞毒性,以及其對不同細胞系的基因轉(zhuǎn)染性能。具體工作如下:1.利用混酸氧化處理石墨烯得到氧化石墨烯,采用ftir、tem、xps和zeta電位對其表面官能團和表面電位及其粒徑進行了表征;用噻唑藍(mtt)法和細胞毒性檢測試劑盒(cck-8)評價了所制備的材料對不同細胞系的活力影響;用酶聯(lián)免疫吸附試劑盒(elisa)測定a375、hela和mcf-7細胞表面整合素αvβ3(itgαvβ3)的含量和用活性氧檢測試劑盒檢測不同濃度的go-chit-rgdnps誘導a375細胞、宮頸癌細胞(hela)和乳腺癌細胞(mcf-7)產(chǎn)生的活性氧(ros)。結(jié)果表明,混酸處理后的氧化石墨烯比未處理石墨烯具有更好的生物相容性和在溶液中的穩(wěn)定性。go-chit-rgdnps對a375細胞的特異性毒性是go、chit和rgd三者共同作用的結(jié)果;且其對正常細胞(人臍靜脈內(nèi)皮細胞、huvec)活力影響較小,結(jié)果表明可能是由于a375表面的整合素含量較高,go-chit-rgdnps能與其特異性結(jié)合,從而使a375細胞內(nèi)的活性氧含量升高,導致細胞凋亡。2.利用edc和nhs作偶聯(lián)劑的方法在溫和的條件下合成了go-rgd、go-aba和go-gal,并采用ftir和zeta電位對其是否成功偶聯(lián)和表面電位及粒徑進行表征。用wst-8法評價了go-rgd和go-aba對a375、hela和mcf-7細胞的毒性和go-gal對a375、hela和肝癌細胞(hepg-2)的毒性。結(jié)果表明,go-rgd對a375具有特異性毒性,可能是由于a375表面的整合素過表達,且GO-RGD能與其特異性結(jié)合使細胞內(nèi)產(chǎn)生的活性氧含量增多,致使細胞凋亡。3.利用EDC和NHS作偶聯(lián)劑的方法在溫和的條件下合成了GO-PAMAM-GA,并采用FTIR、TEM和Zeta電位對其是否成功偶聯(lián)、微觀形貌和表面電位和粒徑進行表征。用WST-8法評價了GO-PAMAM-GA對A375、HeLa和MCF-7細胞的毒性,GO和GO-PAMAM對人神經(jīng)母細胞瘤細胞(SK-N-SH)的毒性。利用GO-PAMAM-GA復(fù)合物作為基因載體介導pEGFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染A375和MCF-7細胞的性能研究。結(jié)果表明,GO-PAMAM-GA對細胞的生物相容性差,雖可以將pEGFP-N1轉(zhuǎn)運至細胞內(nèi),并成功表達,但轉(zhuǎn)染效率不高,GO和GO-PAMAM對SK-N-SH細胞的生物相容性均較好。
【關(guān)鍵詞】：石墨烯 功能化修飾 體外細胞毒性 基因轉(zhuǎn)染性能
【學位授予單位】：湖南師范大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：Q-33;TQ127.11
【目錄】：

• 中文摘要3-6
• ABSTRACT6-12
• 第一章 緒論12-22
• 1.1 腫瘤的靶向治療12-13
• 1.2 石墨烯簡介13-15
• 1.2.1 石墨烯的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)13
• 1.2.2 石墨烯的功能化13-14
• 1.2.3 石墨烯在生物醫(yī)學領(lǐng)域的應(yīng)用14-15
• 1.3 整合素15-17
• 1.3.1 整合素 α_v?_3的結(jié)構(gòu)與功能特點15-16
• 1.3.2 RGD肽的結(jié)構(gòu)及其功能16-17
• 1.4 唾液酸17-18
• 1.4.1 唾液酸結(jié)構(gòu)與存在17
• 1.4.2 唾液酸在惡性腫瘤中的表達17
• 1.4.3 唾液酸在惡性腫瘤細胞中的生物行為17-18
• 1.4.4 唾液酸與惡性腫瘤防治的展望18
• 1.5 聚酰胺-胺（PAMAM）18-20
• 1.5.1 PAMAM樹形分子的性質(zhì)18-20
• 1.5.2 PAMAM樹狀大分子在基因載體方面的運用20
• 1.6 本文構(gòu)思20-22
• 第二章 氧化石墨烯-衍生殼聚糖雜化物的細胞毒性研究22-46
• 2.1 引言22-23
• 2.2 實驗部分23-27
• 2.2.1 試劑與儀器23-24
• 2.2.2 細胞培養(yǎng)24-25
• 2.2.3 石墨烯復(fù)合物的合成25
• 2.2.4 整合素 α_vβ_3含量的測定25-26
• 2.2.5 MTT和WST-8 實驗26-27
• 2.2.6 活性氧測定27
• 2.3 結(jié)果與討論27-44
• 2.3.1 GO的紅外和電子衍射分析27-28
• 2.3.2 經(jīng)混酸處理后得到的GO羧基含量表征28
• 2.3.3 兩種GO在不同溶劑中表面電位、粒徑分析表征比較28-29
• 2.3.4 兩種GO的分散性表征29-30
• 2.3.5 GO及未處理石墨烯對細胞毒性研究30-35
• 2.3.6 復(fù)合物納米粒子對細胞的毒性研究35-43
• 2.3.7 整合素α_Vβ_3含量的測定結(jié)果43
• 2.3.8 活性氧測定結(jié)果43-44
• 2.4 小結(jié)44-46
• 第三章 氧化石墨烯-配基復(fù)合物的合成及其細胞毒性研究46-62
• 3.1 引言46
• 3.2 實驗部分46-48
• 3.2.1 試劑與儀器46-47
• 3.2.2 樣品的制備47
• 3.2.3 WST-8 法檢測樣品對細胞的毒性47
• 3.2.4 活性氧測定47-48
• 3.3 結(jié)果與討論48-60
• 3.3.1 GO-RGD、GO-ABA和GO-GAL的FTIR分析48-49
• 3.3.2 樣品在溶劑中表面電位和粒徑分析表征49-51
• 3.3.3 樣品分散性表征51-52
• 3.3.4 WST-8 法檢測樣品對細胞的毒性52-59
• 3.3.5 活性氧測定結(jié)果59-60
• 3.4 小結(jié)60-62
• 第四章 氧化石墨烯-聚酰胺-胺-葡萄糖酸體外細胞毒性和pEGFP-N1轉(zhuǎn)染性能研究62-74
• 4.1 引言62
• 4.2 實驗部分62-64
• 4.2.1 試劑和儀器62-63
• 4.2.2 GO-PAMAM-GA復(fù)合物樣品的制備63
• 4.2.3 WST-8 法檢測復(fù)合物對細胞的毒性63-64
• 4.2.4 GO-PAMAM-GA復(fù)合物介導pEGFP基因?qū)毎D(zhuǎn)染實驗64
• 4.3 結(jié)果與討論64-73
• 4.3.1 GO-PAMAM-GA的FTIR分析64-65
• 4.3.2 GO-PAMAM-GA在溶劑中表面電荷和粒徑分析表征65-66
• 4.3.3 GO-PAMAM-GA分散性能表征66
• 4.3.4 材料對細胞毒性研究66-71
• 4.3.6 GO-PAMAM-GA介導pEGFP-N1基因?qū)毎D(zhuǎn)染性能研究71-73
• 4.4 本章小結(jié)73-74
• 總結(jié)74-76
• 參考文獻76-83
• 附錄83-84
• 致謝84-85

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本文編號：728378