本文關(guān)鍵詞：新型抗菌肽的設(shè)計(jì)、生物活性及與磷脂膜的相互作用，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：抗菌肽是組成免疫系統(tǒng)的重要內(nèi)源性抗菌分子。它們大多含10-50個(gè)氨基酸,其中大約有50%為疏水性氨基酸,并且富含正電荷氨基酸�？咕木哂袃纱笸怀鰞�(yōu)點(diǎn):第一,抗菌肽大多具有廣譜抗菌性;第二,抗菌肽的主要作用靶點(diǎn)是微生物的細(xì)胞膜,微生物很難對(duì)此產(chǎn)生抗藥性。所以,抗菌肽有望成為新一代的抗菌藥物。然而,在臨床應(yīng)用之前抗菌肽的作用機(jī)理、生物利用率、副作用等基本問題需要解決。因此,基礎(chǔ)性研究以及臨床應(yīng)用都需要高質(zhì)量的多肽來滿足需求。從頭設(shè)計(jì)是一種快速、高效的獲得抗菌肽的方式之一。本論文基于已有抗菌肽的組成和結(jié)構(gòu)特點(diǎn)設(shè)計(jì)、合成了新型的抗菌肽,對(duì)所設(shè)計(jì)的多肽進(jìn)行了生物活性的檢驗(yàn),并利用模擬生物膜對(duì)所設(shè)計(jì)多肽與生物膜之間的相互作用進(jìn)行了研究,從分子水平上為抗菌肽的活性提供了初步的依據(jù)。本文首先利用微量熱泳動(dòng)法研究了具有較好抑菌活性、低細(xì)胞毒性和溶血性的抗菌肽l-RW與模擬生物膜-脂質(zhì)體間的相互作用,在分子水平上為抗菌肽的設(shè)計(jì)提供依據(jù),并據(jù)此提出了新型的脂肽類抗菌肽的設(shè)計(jì)。實(shí)驗(yàn)比較了抗菌肽l-RW對(duì)細(xì)菌生物膜的主要成分磷脂酰甘油(DMPG)以及細(xì)胞生物膜主要成分磷脂酰膽堿(DMPC)的親和力的大小。結(jié)果表明l-RW對(duì)帶負(fù)電荷的DMPG脂質(zhì)體親和力較大,選擇性更強(qiáng),靜電作用對(duì)多肽與脂質(zhì)體間的相互作用產(chǎn)生巨大的影響。與PBS緩沖溶液相比,在MH細(xì)菌培養(yǎng)基中多肽l-RW與脂質(zhì)體DMPG相互作用更強(qiáng),在細(xì)胞培養(yǎng)液RH1640、0.9%Na Cl中多肽l-RW與脂質(zhì)體DMPC的相互作用更弱。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果和l-RW的生物活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本一致。此外,我們還比較了l-RW對(duì)各種細(xì)菌細(xì)胞膜提取物的親和力大小,結(jié)果顯示l-RW對(duì)金色葡萄球菌細(xì)胞膜脂質(zhì)成分的選擇性要強(qiáng)于對(duì)大腸桿菌、銅綠單假胞桿菌,該結(jié)果與l-RW對(duì)金色葡萄球菌具有更強(qiáng)的抑菌效果結(jié)果一致。此外,我們還考察了在不同濃度的胎牛血清中l(wèi)-RW與不同脂質(zhì)體親和力的大小,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明隨著血清濃度的增大,l-RW與DMPG/DMPC的親和力均減弱。進(jìn)一步的研究表明血清中的血清白蛋白成分減弱了l-RW與磷脂的親和力。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明在生物液體中l(wèi)-RW的利用度會(huì)減弱,在臨床應(yīng)用時(shí)可用于外用。由于利用微量熱泳動(dòng)法所獲得的抗菌肽l-RW和脂質(zhì)成分的親和力與l-RW的生物活性基本一致,因此親和力的大小可以在一定程度上預(yù)測(cè)抗菌肽的生物活性。抗菌肽l-RW具有較好抑菌活性、低細(xì)胞毒性和溶血性,和其組成和結(jié)構(gòu)具有重要的關(guān)系。l-RW富含精氨酸和色氨酸且結(jié)構(gòu)上形成親水疏水的兩親性。然而由于多種酶的降解作用,由天然氨基酸所組成的多肽在體內(nèi)穩(wěn)定性不高,不利于其在體內(nèi)發(fā)揮作用。因此在抗菌肽設(shè)計(jì)中引入非天然氨基酸基團(tuán)可以降低酶的降解,有效提高抗菌肽在體內(nèi)的穩(wěn)定性,提高其利用效率。脂肪酸是一種生物膜中磷脂的組成部分,具有較高的疏水性。將該基團(tuán)引入抗菌肽設(shè)計(jì),替代抗菌肽中的疏水氨基酸,將有可能在保持抗菌肽活性的同時(shí),減少酶對(duì)其的降解,提高多肽的穩(wěn)定性。結(jié)合l-RW的特點(diǎn),我們采用脂肪酸作為疏水基團(tuán),帶正電的精氨酸作為親水頭基設(shè)計(jì)新型的脂肽類抗菌肽。通過研究其抑菌活性、溶血性等生物活性,探究脂肪酸鏈長短和數(shù)目、氨基酸頭基電荷、色氨酸位置等因素對(duì)脂肽活性的影響。C12-R4具有一定的抑菌性且溶血性較低,其他單脂肽雖具有抑菌活性但其溶血性較強(qiáng)。色氨酸影響脂肽的生物活性,它的引入使得脂肽的雙親性結(jié)構(gòu)變得混亂,從而使其活性性下降。雙脂肪酸鏈的疏水性過強(qiáng),影響了其生物活性。此外,本文通過探究脂肽與模擬生物膜的相互作用,初步討論了新型脂肽對(duì)生物膜的作用機(jī)理。我們通過探究脂肽與DMPG、DMPC脂質(zhì)體作用后脂質(zhì)體粒徑的改變來研究脂肽對(duì)生物膜的破壞作用。結(jié)果表明單鏈脂肽均能瓦解磷脂膜,雙鏈肽均不能有效的瓦解磷脂膜與其生物活性相一致。因此脂肽對(duì)膜的破壞作用是脂肽生物活性的重要來源。色氨酸熒光猝滅實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明脂肽的親水頭基能夠有效地進(jìn)入到脂質(zhì)體內(nèi)部,從而發(fā)揮破壞作用。對(duì)脂肽-磷脂單分子層的混合體系進(jìn)行了熱力學(xué)穩(wěn)定性分析,結(jié)果表明脂肽與磷脂易于混合。通過本論文我們可以得出:利用微量熱泳動(dòng)技術(shù)可以獲得抗菌肽和脂質(zhì)成分的親和力大小,在一定程度上預(yù)測(cè)抗菌肽的生物活性;由精氨酸和脂肪酸鏈所組成的脂肽表現(xiàn)出較高的抑菌活性,但較大的疏水基團(tuán)也使得脂肽表現(xiàn)出較高的溶血性,限制了其應(yīng)用,因此靜電作用、疏水性等參數(shù)共同控制抗菌肽的生物活性,必須使這些參數(shù)達(dá)到平衡,抗菌肽才可能表現(xiàn)出理想的生物活性。該研究為今后抗菌肽的設(shè)計(jì)以及篩選提供了新的方法及思路。
【關(guān)鍵詞】：抗菌肽 生物活性 磷脂膜 脂肽
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：TQ465
【目錄】：

• 摘要4-5
• Abstract5-11
• 第一章 緒論11-20
• 1.1 抗菌肽的來源11-13
• 1.1.1 植物源11-12
• 1.1.2 動(dòng)物源12
• 1.1.3 微生物合成12-13
• 1.1.4 人工合成13
• 1.2 抗菌肽的結(jié)構(gòu)以及生物活性13-14
• 1.3 脂肽14-16
• 1.3.1 脂肽的結(jié)構(gòu)15
• 1.3.2 脂肽的分離純化和鑒定15-16
• 1.4 抗菌肽數(shù)據(jù)庫的發(fā)展16
• 1.5 抗菌肽的應(yīng)用16-17
• 1.5.1 抗菌肽在植物領(lǐng)域的應(yīng)用16
• 1.5.2 抗菌肽在食品中的應(yīng)用16-17
• 1.5.3 抗菌肽在藥用領(lǐng)域的研究與應(yīng)用17
• 1.5.4 抗菌肽在水產(chǎn)養(yǎng)殖領(lǐng)域的研究與應(yīng)用17
• 1.6 抗菌肽應(yīng)用中存在的問題17-18
• 1.7 論文的研究目的及意義18
• 1.8 論文的研究?jī)?nèi)容18-20
• 第二章 新型抗菌肽的設(shè)計(jì)20-34
• 2.1 材料和方法21-23
• 2.1.1 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑21
• 2.1.2 實(shí)驗(yàn)方法以及原理21-23
• 2.2 微量熱泳動(dòng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論23-30
• 2.3 抗菌肽的設(shè)計(jì)30-34
• 第三章 新型脂肽的生物活性34-42
• 3.1 材料與方法34-36
• 3.1.1 實(shí)驗(yàn)菌株34
• 3.1.2 主要試劑與耗材34-35
• 3.1.3 儀器設(shè)備35
• 3.1.4 脂肽的抑菌性實(shí)驗(yàn)35
• 3.1.5 脂肽的溶血實(shí)驗(yàn)35-36
• 3.2 脂肽的抑菌性實(shí)驗(yàn)36-37
• 3.3 脂肽的溶血性37-41
• 3.4 小結(jié)41-42
• 第四章 新型抗菌肽與磷脂膜的相互作用42-66
• 4.1 材料與方法42-43
• 4.1.1 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑42
• 4.1.2 脂質(zhì)體實(shí)驗(yàn)42
• 4.1.3 熒光淬滅法研究脂肽與脂質(zhì)體膜的相互作用42-43
• 4.1.4 LB膜法研究抗菌肽與磷脂間的相互作用43
• 4.2 結(jié)果與討論43-65
• 4.2.1 脂質(zhì)體實(shí)驗(yàn)43-47
• 4.2.2 熒光猝滅法研究脂肽與脂質(zhì)體的相互作用47-53
• 4.2.3 LB膜法研究研究脂肽與磷脂膜的相互作用53-65
• 4.3 小結(jié)65-66
• 第五章 結(jié)論66-67
• 參考文獻(xiàn)67-72
• 致謝72-73
• 附錄 碩士研究生期間發(fā)表論文73

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