本文關(guān)鍵詞：基于隨機(jī)骨料模型的混凝土性能多尺度數(shù)值模擬研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus,簡稱VP)是一種嗜鹽性革蘭氏陰性致病菌,人們?nèi)羰秤昧吮籚P菌污染的生的或未煮熟的食物后可能會引起發(fā)熱、惡心、嘔吐、腹痛、腹瀉等急性胃腸炎癥狀。VP菌可以游離于海水環(huán)境,也可以在固相表面形成生物膜,生物膜是其適應(yīng)不利環(huán)境而采取的主要生存策略,生物膜形成受環(huán)二鳥苷酸(Cyclicdiguanylate,c-di-GMP)信號通路和密度感應(yīng)(Quorumsensing,QS)系統(tǒng)的調(diào)節(jié)。VP菌在小核糖核酸RNA(Quorum-regulatedsmallRNAs,QrrsRNAs)的參與下,調(diào)節(jié)全局調(diào)控子OpaR和AphA的表達(dá)。VP菌在高密度時,OpaR起核心調(diào)節(jié)作用；在低密度時,AphA起核心調(diào)節(jié)作用,通過表型結(jié)果顯示它能促進(jìn)生物膜形成和毒力因子的表達(dá),但是其分子機(jī)制還未被闡明。目的：綜合運(yùn)用表型與分子生化實(shí)驗(yàn)研究AphA蛋白對VP菌生物膜形成的調(diào)節(jié)機(jī)制。方法：首先利用菌落褶皺與結(jié)晶紫染色實(shí)驗(yàn)比較野生株(WT)和aphA突變株(△AaphA)的表型差異；進(jìn)而再利用色譜串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-MS/MS)的方法檢測WT與△aphA各自中c-di-GMP分子的含量。利用生物學(xué)軟件設(shè)計AphA蛋白位于胞漿區(qū)的N-末端DNA結(jié)合域的上下游引物,擴(kuò)增AphA蛋白N-末端DNA結(jié)合域,然后酶切連接到pET-28a-c(+)質(zhì)粒,轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(λDE3)中,通過鑒定篩選出AphA的蛋白表達(dá)株,所得菌株經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后,再經(jīng)Ni-NTA柱純化,最后透析濃縮得到帶His標(biāo)簽的AphA蛋白。利用生物信息學(xué)的方法,對AphA蛋白與DNA的結(jié)合基序進(jìn)行預(yù)測,并篩選感興趣的基因,通過凝膠遷移阻滯實(shí)驗(yàn)(Electrophoreticmobilityshiftassay,EMSA)驗(yàn)證His-AphA蛋白對生物膜靶基因啟動子區(qū)是否具有直接的相互作用。利用生物學(xué)軟件設(shè)計9個生物膜基因(包括胞外多糖和c-di-GMP合成的基因)的啟動子區(qū)上下游引物,擴(kuò)增這些毒力基因啟動子區(qū),然后酶切連接到pHRP309質(zhì)粒上,轉(zhuǎn)化到大腸桿菌JM109中,鑒定、測序并篩選出陽性的單克隆,提取重組質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化到副溶血弧菌野生株(WT)和aphA突變株(△aphA)中,通過測定野生株(WT)和突變株(△aphA)中β-半乳糖苷酶活性的差異,研究AphA對靶基因的調(diào)控關(guān)系。提取WT和△aphA的總RNA,采用實(shí)時定量RT-PCR的方法研究AphA對scrABC和scrG的調(diào)控關(guān)系；結(jié)果：通過表型實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示AphA能促進(jìn)VP菌生物膜的形成,利用色譜串聯(lián)質(zhì)譜的方法檢測WT與△aphA各自中c-di-GMP分子的含量,結(jié)果顯示AphA匕促進(jìn)c-di-GMP的合成；利用大腸桿菌BL21(λSE3)表達(dá)系統(tǒng)成功表達(dá)出了有活性的His-AphA蛋白。EMSA實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：His-AphA蛋白能特異性地結(jié)合到VP0376.VP0485和VP1469的啟動子區(qū),VPA1513(scrABC).VP1377(scrG)、VP0117.VPA0198.VP1403和VP1476的啟動子區(qū)無直接結(jié)合作用；LacZ艮告基因融合實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示AphA能激活VP1469和VP0485的轉(zhuǎn)錄表達(dá),而對VPA1513.VP1377和VP0376具有轉(zhuǎn)錄抑制作用；利用實(shí)時定量RT-PCR的方法研究表明AphA抑制scrABC和scrG的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。結(jié)論：所表達(dá)的His-AphA蛋白可用于后續(xù)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制研究；AphA通過直接激活VP0485.VP1469的轉(zhuǎn)錄表達(dá),直接抑制VP0376的轉(zhuǎn)錄表達(dá),間接抑制scrABC.scrG的轉(zhuǎn)錄,從而促進(jìn)VP菌胞外多糖和c-di-GMP的合成,進(jìn)而促進(jìn)其生物膜的形成,使VP菌具有高感染性。
【作者】黃倩；
【導(dǎo)師】黎曉敏；周冬生；
【作者基本信息】西南大學(xué)，基礎(chǔ)獸醫(yī)學(xué)，2014，，碩士
【關(guān)鍵詞】副溶血弧菌；AphA；DNA結(jié)合活性；轉(zhuǎn)錄調(diào)控；

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