本文關鍵詞：基于隨機骨料模型的混凝土性能多尺度數(shù)值模擬研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus,簡稱VP)是一種嗜鹽性革蘭氏陰性致病菌,人們?nèi)羰秤昧吮籚P菌污染的生的或未煮熟的食物后可能會引起發(fā)熱、惡心、嘔吐、腹痛、腹瀉等急性胃腸炎癥狀。VP菌可以游離于海水環(huán)境,也可以在固相表面形成生物膜,生物膜是其適應不利環(huán)境而采取的主要生存策略,生物膜形成受環(huán)二鳥苷酸(Cyclicdiguanylate,c-di-GMP)信號通路和密度感應(Quorumsensing,QS)系統(tǒng)的調(diào)節(jié)。VP菌在小核糖核酸RNA(Quorum-regulatedsmallRNAs,QrrsRNAs)的參與下,調(diào)節(jié)全局調(diào)控子OpaR和AphA的表達。VP菌在高密度時,OpaR起核心調(diào)節(jié)作用；在低密度時,AphA起核心調(diào)節(jié)作用,通過表型結(jié)果顯示它能促進生物膜形成和毒力因子的表達,但是其分子機制還未被闡明。目的：綜合運用表型與分子生化實驗研究AphA蛋白對VP菌生物膜形成的調(diào)節(jié)機制。方法：首先利用菌落褶皺與結(jié)晶紫染色實驗比較野生株(WT)和aphA突變株(△AaphA)的表型差異；進而再利用色譜串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-MS/MS)的方法檢測WT與△aphA各自中c-di-GMP分子的含量。利用生物學軟件設計AphA蛋白位于胞漿區(qū)的N-末端DNA結(jié)合域的上下游引物,擴增AphA蛋白N-末端DNA結(jié)合域,然后酶切連接到pET-28a-c(+)質(zhì)粒,轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(λDE3)中,通過鑒定篩選出AphA的蛋白表達株,所得菌株經(jīng)IPTG誘導后,再經(jīng)Ni-NTA柱純化,最后透析濃縮得到帶His標簽的AphA蛋白。利用生物信息學的方法,對AphA蛋白與DNA的結(jié)合基序進行預測,并篩選感興趣的基因,通過凝膠遷移阻滯實驗(Electrophoreticmobilityshiftassay,EMSA)驗證His-AphA蛋白對生物膜靶基因啟動子區(qū)是否具有直接的相互作用。利用生物學軟件設計9個生物膜基因(包括胞外多糖和c-di-GMP合成的基因)的啟動子區(qū)上下游引物,擴增這些毒力基因啟動子區(qū),然后酶切連接到pHRP309質(zhì)粒上,轉(zhuǎn)化到大腸桿菌JM109中,鑒定、測序并篩選出陽性的單克隆,提取重組質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化到副溶血弧菌野生株(WT)和aphA突變株(△aphA)中,通過測定野生株(WT)和突變株(△aphA)中β-半乳糖苷酶活性的差異,研究AphA對靶基因的調(diào)控關系。提取WT和△aphA的總RNA,采用實時定量RT-PCR的方法研究AphA對scrABC和scrG的調(diào)控關系；結(jié)果：通過表型實驗結(jié)果顯示AphA能促進VP菌生物膜的形成,利用色譜串聯(lián)質(zhì)譜的方法檢測WT與△aphA各自中c-di-GMP分子的含量,結(jié)果顯示AphA匕促進c-di-GMP的合成；利用大腸桿菌BL21(λSE3)表達系統(tǒng)成功表達出了有活性的His-AphA蛋白。EMSA實驗結(jié)果表明：His-AphA蛋白能特異性地結(jié)合到VP0376.VP0485和VP1469的啟動子區(qū),VPA1513(scrABC).VP1377(scrG)、VP0117.VPA0198.VP1403和VP1476的啟動子區(qū)無直接結(jié)合作用；LacZ艮告基因融合實驗結(jié)果顯示AphA能激活VP1469和VP0485的轉(zhuǎn)錄表達,而對VPA1513.VP1377和VP0376具有轉(zhuǎn)錄抑制作用；利用實時定量RT-PCR的方法研究表明AphA抑制scrABC和scrG的轉(zhuǎn)錄表達。結(jié)論：所表達的His-AphA蛋白可用于后續(xù)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制研究；AphA通過直接激活VP0485.VP1469的轉(zhuǎn)錄表達,直接抑制VP0376的轉(zhuǎn)錄表達,間接抑制scrABC.scrG的轉(zhuǎn)錄,從而促進VP菌胞外多糖和c-di-GMP的合成,進而促進其生物膜的形成,使VP菌具有高感染性。
【作者】黃倩；
【導師】黎曉敏；周冬生；
【作者基本信息】西南大學，基礎獸醫(yī)學，2014，，碩士
【關鍵詞】副溶血弧菌；AphA；DNA結(jié)合活性；轉(zhuǎn)錄調(diào)控；

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  本文關鍵詞：基于隨機骨料模型的混凝土性能多尺度數(shù)值模擬研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。