發(fā)布時(shí)間：2018-03-01 16:08

  本文關(guān)鍵詞： 產(chǎn)氣腸桿菌 生物制氫 厭氧發(fā)酵 基因敲除 響應(yīng)面法 氫酶　出處：《華中科技大學(xué)》2015年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：隨著當(dāng)前化石能源危機(jī)以及其引發(fā)的全球氣候變化和環(huán)境污染的日益嚴(yán)重,對(duì)清潔環(huán)保的綠色能源開發(fā)與探索顯得更為迫切。氫能作為一種能量密度大、可再生、清潔環(huán)保的綠色可替代能源受到廣泛關(guān)注。在諸多產(chǎn)氫技術(shù)中,厭氧發(fā)酵產(chǎn)氫技術(shù)具有反應(yīng)條件溫和、反應(yīng)器設(shè)計(jì)簡單及可利用廉價(jià)有機(jī)廢物制備等特點(diǎn),使其成為氫能源和環(huán)保領(lǐng)域研究熱點(diǎn)。但厭氧發(fā)酵較低的產(chǎn)氫效率一直是技術(shù)瓶頸,嚴(yán)重制約產(chǎn)業(yè)化發(fā)展。因此,厭氧發(fā)酵制氫對(duì)高效產(chǎn)氫菌的選育尤為重要,成為當(dāng)前厭氧發(fā)酵制氫工業(yè)化的研究重點(diǎn),目前利用基因工程和輔酶工程等新技術(shù)選育高效產(chǎn)氫工程菌成為研究熱點(diǎn)方向之一。本研究以產(chǎn)氣腸桿菌Enterobacter aerogenes CCTCC AB91102為出發(fā)菌株,該菌株具有易于培養(yǎng)、底物適用范圍廣和發(fā)酵周期短等諸多優(yōu)點(diǎn),使之成為具有工業(yè)化潛力的產(chǎn)氫菌種之一。產(chǎn)氣腸桿菌厭氧發(fā)酵是一個(gè)相對(duì)復(fù)雜的代謝過程,對(duì)其產(chǎn)氫代謝的研究包括甲酸裂解途徑和NADH途徑。通過甲酸裂解途徑的氫酶基因的同源表達(dá),增加氫酶的表達(dá)量,從而達(dá)到提高工程菌產(chǎn)氫效率的目的。此外,還對(duì)其發(fā)酵條件做了優(yōu)化,以進(jìn)一步提高產(chǎn)氫量。同時(shí),針對(duì)產(chǎn)氣腸桿菌另一產(chǎn)氫途徑(NADH途徑)展開了代謝機(jī)理初步探索。主要研究內(nèi)容和結(jié)果摘要如下:1.構(gòu)建了過表達(dá)氫酶-3亞基的同源重組工程菌AB91102-hyc E和AB91102-hyc G。以產(chǎn)氣腸桿菌E.aerogenes AB91102基因組DNA為模板,擴(kuò)增得到氫酶-3大亞基(Hyc E)hyc E基因(Gen Bank No.KM096473)、膜結(jié)合蛋白(Hyc F)hyc F基因(Gen Bank No.KM096474)以及小亞基(Hyc G)hyc G基因(Gen Bank No.KM096475)。針對(duì)hyc E和hyc G兩個(gè)基因成功構(gòu)建了表達(dá)質(zhì)粒p ET28a-Pkan-hyc E和p ET28a-Pkan-hyc G,并將表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入產(chǎn)氣腸桿菌AB91102中,獲得AB91102-hyc E和AB91102-hyc G兩株高效工程菌�；蚬こ叹a(chǎn)氫特性研究結(jié)果顯示,工程菌產(chǎn)氫效率較原始菌株分別提高11.51%和6.77%。發(fā)酵液成分及產(chǎn)氫貢獻(xiàn)分析表明:基因工程菌甲酸裂解途徑的產(chǎn)氫量分別提高了5.4%和1.9%,NADH途徑的產(chǎn)氫量分別提高了54.8%和40.6%。該結(jié)果表明氫酶-3亞基過表達(dá)不僅可提高甲酸裂解途徑產(chǎn)氫,而且可促進(jìn)NADH途徑產(chǎn)氫。2.優(yōu)化工程菌E.aerogenes AB91102-hyc E厭氧發(fā)酵條件。首先,采用單因素優(yōu)化了影響發(fā)酵的關(guān)鍵參數(shù)接種量、溫度和初始p H,結(jié)果表明:最適接種量為10%,最適溫度為35°C,最適初始p H為6.0。在單因素優(yōu)化基礎(chǔ)上,進(jìn)一步運(yùn)用Central Composite Design(CCD)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn),利用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SAS 9.0分析和預(yù)測(cè)響應(yīng)值。預(yù)測(cè)最優(yōu)發(fā)酵條件:接種量為11.6%,溫度為34.6°C,初始p H值為6.07。厭氧發(fā)酵產(chǎn)氫驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)得到的實(shí)際產(chǎn)氫效率為1.175 mol H2/mol葡萄糖,與模型預(yù)測(cè)值1.169mol H2/mol葡萄糖非常接近,表明預(yù)測(cè)模型的可靠性。3.考察了產(chǎn)氣腸桿菌氫酶-3的Hyc E、Hyc F和Hyc G亞基功能。利用Red重組系統(tǒng)完成抗性標(biāo)記基因與氫酶-3基因進(jìn)行同源重組,從產(chǎn)氣腸桿菌基因組成功分別敲除了hyc E、hyc F和hyc G基因,并消除抗性基因,獲得突變菌株分別命名為AB91102-Δhyc E、AB91102-Δhyc F和AB91102-Δhyc G。厭氧恒化實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,突變菌株總NAD(H)濃度變化不大,但NADH/NAD+比值從1.06分別提高到1.39、1.45和1.41,對(duì)于葡萄糖的攝取量分別下降了47.85%、46.49%和48.95%。厭氧批次發(fā)酵實(shí)驗(yàn)表明,突變菌株的產(chǎn)氫量降至零,葡萄糖的攝取量分別下降了35.1%、34.5%和36.0%。此外,突變菌NADH途徑的產(chǎn)氫量為零,參與NADH途徑的氫酶檢測(cè)不到活性,表明氫酶-3基因敲除對(duì)甲酸裂解途徑和NADH途徑均產(chǎn)生阻斷或抑制的作用,是產(chǎn)氣腸桿菌復(fù)雜產(chǎn)氫途徑的關(guān)鍵酶。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：TQ116.2;TQ929

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