及時、精確預(yù)報赤潮的發(fā)生和快速、準(zhǔn)確地對赤潮藻進(jìn)行定性、定量分析成為當(dāng)今赤潮研究的主要方向之一,但是通過現(xiàn)有的檢測手段還不能完全準(zhǔn)確的預(yù)報赤潮的發(fā)生,特別是快速、準(zhǔn)確的定性、定量檢測赤潮藻。 本研究選取我國近海三種不同粒徑的赤潮藻—赤潮異彎藻、共生甲藻、鏈狀亞歷山大藻為研究對象,通過免疫家兔制備了它們的多克隆抗體,對多克隆抗體進(jìn)行效價測定,以反映抗血清中抗海藻IgG分子數(shù)目的多少和它們與相應(yīng)海藻細(xì)胞結(jié)合能力的大小,同時對比不同形態(tài)大小的藻細(xì)胞抗體效價的差異和規(guī)律。對所獲得抗血清的特異性進(jìn)行了鑒定,并采用吸附封閉處理的方法提高抗體的特異性。結(jié)果表明未經(jīng)吸附處理的赤潮異彎藻、共生甲藻效價分別達(dá)到1:41 000、1:18 000以上,顯示是高親合力的抗體;鏈狀亞歷山大藻抗體效價達(dá)到1:3 500,相比另兩種藻的效價較低;吸附處理后的三種多克隆抗體的特異性明顯提高,而效價有所下降。三種多克隆抗體與各自藻細(xì)胞均有很強(qiáng)的結(jié)合力。競爭酶聯(lián)免疫法對藻細(xì)胞的檢測表明制備的多克隆抗體與其他種類藻細(xì)胞交叉反應(yīng)較弱,特異性較好。 采用間接熒光免疫顯微檢測技術(shù)對赤潮藻細(xì)胞表面抗原分布,以及多克隆抗體的特異性進(jìn)行了更加直觀的研究,結(jié)合流式細(xì)胞儀分析,快速定性、定量地檢測樣品中的藻細(xì)胞。結(jié)果表明三種多克隆抗體與各自藻細(xì)胞均有很強(qiáng)的結(jié)合力,赤潮異彎藻和共生甲藻的熒光信號均勻分布于細(xì)胞表面,鏈狀亞歷山大藻細(xì)胞的熒光信號在細(xì)胞表面分布不均勻,主要集中在腹部橫溝內(nèi)。制備的多克隆抗體只與自身藻細(xì)胞結(jié)合,與另外兩種藻細(xì)胞無交叉反應(yīng)。鏈狀亞歷山大藻抗體只與自身藻細(xì)胞結(jié)合,與塔馬亞歷山大藻無交叉反應(yīng),可作為同屬內(nèi)不同種的鑒別。利用流式細(xì)胞術(shù)檢測表明該方法通過激發(fā)熒光光譜范圍的不同可以區(qū)分熒光標(biāo)記的藻細(xì)胞,在定量方面與顯微鏡觀察計數(shù)存在一定差異,赤潮異彎藻鏡檢結(jié)果同流式檢測結(jié)果的差異為+5.16%,共生甲藻鏡檢結(jié)果同流式檢測結(jié)果的差異為+4.65%,鏈狀亞歷山大藻鏡檢結(jié)果同流式檢測結(jié)果的差異為+11.76%,可能是多克隆抗體與藻細(xì)胞結(jié)合率以及熒光標(biāo)記二抗與多克隆抗體的結(jié)合率的影響有關(guān),造成顯微計數(shù)結(jié)果偏大。該方法具有檢測快、靈敏度高、結(jié)果穩(wěn)定,不需要大量的形態(tài)分類學(xué)知識就可對某一特定的赤潮藻進(jìn)行定性、定量分析;利用免疫流式細(xì)胞術(shù)的檢測過程中,藻細(xì)胞的固定、標(biāo)記、洗脫容易導(dǎo)致細(xì)胞丟失,如果通過多次回收、富集的方法可以盡量的減少細(xì)胞的丟失。 采用rProtein G親和純化多克隆抗體,采用NHS標(biāo)記法將抗體標(biāo)記到羧基化磁珠表面,獲得免疫磁珠。免疫磁珠與細(xì)胞表面相應(yīng)分子特異性結(jié)合,或者已包被二抗(羊抗小鼠或羊抗大鼠)的磁珠與預(yù)先已與細(xì)胞表面分子特異結(jié)合的一抗結(jié)合。磁珠攜帶與之結(jié)合的細(xì)胞吸附于分離柱/試管上,實現(xiàn)陽性細(xì)胞分離或陰性細(xì)胞的分離,利用免疫磁珠分選方法對赤潮異彎藻進(jìn)行定性、定量研究,結(jié)果表明免疫磁珠分離赤潮異彎藻細(xì)胞純度可達(dá)85%--95%,得率在60%--90%左右,可進(jìn)行特定藻細(xì)胞的分離和富集,還可進(jìn)行活細(xì)胞的分選,方法簡便、操作靈活。實驗過程中洗脫的時間、強(qiáng)度會影響到研究的結(jié)果,造成存在交叉反應(yīng)的假象,因此需要試驗條件進(jìn)行優(yōu)化。此外,過低的濃度會影響結(jié)果的準(zhǔn)確率。 本文還探索了利用噬菌體表面展示肽庫技術(shù)篩選針對赤潮異彎藻的特異多肽。通過篩選特異結(jié)合的多肽,研究赤潮異彎藻細(xì)胞表面抗原位點,用于分離檢測赤潮異彎藻,為赤潮爆發(fā)的前期檢測提供有效的手段。實驗結(jié)果表明,篩選得到的針對赤潮異彎藻細(xì)胞的特異性多肽與其他藻細(xì)胞存在一定的交叉反應(yīng)。造成結(jié)果的原因一方面可能是藻細(xì)胞中存在細(xì)菌等微生物,不能獲得只針對藻細(xì)胞表面抗原的外源多肽。另一方面可能是噬菌體多肽的長度太短,不能與藻細(xì)胞表面抗原發(fā)生特異性結(jié)合,導(dǎo)致交叉反應(yīng)存在。因此,在今后的研究中一方面需要獲得純化藻細(xì)胞,去除細(xì)菌等微生物的影響,另一方面采用更長的噬菌體展示肽庫進(jìn)行篩選,從而獲得特異性更高的外源性多肽。
【學(xué)位單位】：中國海洋大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2008
【中圖分類】：X55
【部分圖文】：

海 區(qū) 赤潮發(fā)生次數(shù) 累計發(fā)生面積（平方公里）2006 年 2007 年 2006 年 2007 年渤海 11 7 2 980 672黃海 2 5 420 655東海 63 60 15 170 9 787南海 17 10 1 270 496合計 93 82 19 840 11 610從 2000 年以后全國赤潮發(fā)生次數(shù)及發(fā)生面積增加顯著，近兩年有所下降面是由于海水富營養(yǎng)化得到控制，另一方面我國建立了完善的赤潮監(jiān)測網(wǎng)，的重視程度提高，采取一定的措施減少了赤潮的發(fā)生（圖 0-1）。

在東海浙江海域發(fā)生上萬平方公里的米氏凱倫藻赤潮；2006 年 5 月在東海長江口海域發(fā)生數(shù)百平方公里的鏈狀亞歷山大藻赤潮；2006 年 9 月在黃海連云港臨近海域發(fā)生裸甲藻赤潮等。有毒有害赤潮的發(fā)生對中國社會發(fā)展和自然生態(tài)安全構(gòu)成了嚴(yán)重威脅。1998 年米氏凱倫藻赤潮導(dǎo)致廣東、香港兩地養(yǎng)殖魚類的大量死亡,造成了數(shù)億元的直接經(jīng)濟(jì)損失。2000～2005 年，中國沿海每年因赤潮造成的直接經(jīng)濟(jì)損失都有數(shù)千萬元，2005 年東海米氏凱倫藻赤潮對南麂島的養(yǎng)殖魚類造成了毀滅性的打擊，僅此一地直接經(jīng)濟(jì)損失就達(dá) 2000 萬元。（周名江等，2007）。與南方海域的赤潮相比，渤海 2007 年共發(fā)生赤潮 7 次，累計面積 672 平方公里，發(fā)生次數(shù)較 2006 年減少 4 次，累計面積減少 2 308 平方公里，未發(fā)生 500 平方公里以上的赤潮（圖 0-2）。黃海 2007 年共發(fā)生赤潮 5 次，累計面積 655 平方公里，發(fā)生次數(shù)與累計面積較上年分別增加 3 次和 235 平方公里（圖 0-3）。黃海、渤海海域主要赤潮藻種有 12 種（表 0-2）。=

圖 0-3 2003-2007 年個月份黃海赤潮次數(shù)（2007 年中國海洋災(zāi)害公報）Fig.0-3 Monthly frequency of red tide occurrences in Yellow Sea (2003-2007)(2007 Report on Marine Disasters of China )表 0-2 黃海、渤海海域主要赤潮藻種Table 0-2 Red Tide Causative Species in Yellow Sea and Bohai WatersGenus: SpeciesDinoflagellates: Alexandrium catenella 、Gymnodinium sanguineum 、Gymnodinium sanguineumRaphidophytes: Chattonella antiqua 、Chattonella marina 、Heterosigma akashiwoHaptophytes: Phaeocystis sp.
【引證文獻(xiàn)】

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前2條

1 邊梅;九龍江口的浮游植物群落以及主要產(chǎn)毒素赤潮種的變化[D];汕頭大學(xué);2011年

2 朱霞;應(yīng)用電致化學(xué)發(fā)光分子探針技術(shù)對微小原甲藻的檢測[D];中國海洋大學(xué);2011年

本文編號：2850841