【摘要】：近年來，對于有毒赤潮及其危害效應(yīng)的研究越來越受到關(guān)注。有毒赤潮的危 害不僅取決于赤潮的生物量，還受到藻細胞毒素含量的影響。對于能夠形成有毒 赤潮的甲藻，其生長和毒素產(chǎn)生受諸多因素影響，其中營養(yǎng)物質(zhì)和微生物是非常 重要的影響因子。本文以微小亞歷山大藻作為模式生物，系統(tǒng)探討了不同類型的 氮、磷營養(yǎng)物質(zhì)對微小亞歷山大藻（Alexandrium minutum）生長和毒素產(chǎn)生的影 響；同時，通過組合抗生素處理，初步探討了甲藻培養(yǎng)系中細菌的去除對其生長 和毒素產(chǎn)生的影響。 研究表明：在氮饑餓條件下，硝酸鈉和酵母浸出粉能促進微小亞歷山大藻的 生長和產(chǎn)毒；高濃度的氯化銨對微小亞歷山大藻有短時的毒性效應(yīng)；這三者培養(yǎng) 的微小亞歷山大藻生長和產(chǎn)毒量相似，生長速率分別為 0.16、0.21 和 0.21/d，最 高細胞毒素含量分別為 12.86、14.64 和 11.85fmol/cell。但尿素對微小亞歷山大藻 的生長和產(chǎn)毒的促進作用都很弱，細胞密度維持在 10,000cells/ml，細胞毒素含 量維持在 6.0－8.0fmol/cell 之間。四種含氮營養(yǎng)鹽對微小亞歷山大藻毒素組成的 影響都很小。 在磷限制條件下，加入磷酸二氫鉀、磷酸甘油和 ATP 均能促進生長和產(chǎn)毒， 最大藻細胞密度分別為 22,700、28,400 和 27,800cells/ml，對數(shù)期生長速率分別 是 0.12、0.14 和 0.15/d，穩(wěn)定期藻細胞毒素含量分別為 22.87、23.98 和 21.80fmol/cell。磷限制不僅使微小亞歷山大藻細胞毒素含量增加，而且顯著改變 毒素組成，表現(xiàn)為 GTX1/4 含量增加，GTX2/3 含量減少。磷限制使藻的堿性磷 酸酶活性升高，添加有機磷營養(yǎng)鹽的藻堿性磷酸酶活性顯著高于添加無機磷營養(yǎng) 鹽的藻。 通過實驗建立了組合抗生素處理消除培養(yǎng)液中細菌的方法。通過 2216E 培養(yǎng) 基培養(yǎng)和細菌 DNA 的 PCR 擴增兩種檢測方法發(fā)現(xiàn)，環(huán)丙沙星、慶大霉素、鏈霉 素和青霉素抗生素組合及環(huán)丙沙星、慶大霉素鏈霉素、青霉素、卡那霉素和新霉 素抗生素組合都能有效除去藻培養(yǎng)液中的細菌。但除去細菌的同時，真菌等大量 I WP=5 張清春 氮、磷營養(yǎng)物質(zhì)與微生物對微小亞歷山大藻生長和毒素產(chǎn)生的影響 碩士學(xué)位論文 的繁殖，微小亞歷山大藻對兩性霉素 B 的抗真菌藥物很敏感，無法直接使用抗 真菌藥物處理。 研究探討了5－甲氧基色胺對微小亞歷山大藻孢囊誘導(dǎo)的條件及其在無菌藻 制備中的可應(yīng)用性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在添加 5－甲氧基色胺后 8 小時內(nèi)，暫時性孢囊的 形成率最高；對數(shù)期微小亞歷山大藻比穩(wěn)定期的對 5－甲氧基色胺敏感；24 小時 后，穩(wěn)定期的微小亞歷山大藻的成孢囊率在 4.0×10-5M 組最高，達到 30.84％； 而對數(shù)期的藻成孢囊率在 2.0×10-5M 組最高，成孢囊率為 12.27％。高濃度組由 于孢囊的破裂使得成孢囊率急劇下降。 通過實驗比較了誘導(dǎo)產(chǎn)生的孢囊對不同抗生素處理的耐受狀況。除了用兩性 霉素 B、兩性霉素 B 和 5－氟胞嘧啶處理 3 天的孢囊不能形成營養(yǎng)細胞外，其它 組均有孢囊形成營養(yǎng)細胞。盡管目前尚未應(yīng)用孢囊誘導(dǎo)技術(shù)建立起真正意義上的 無菌藻，但這一技術(shù)顯示了較好的應(yīng)用潛力，值得繼續(xù)嘗試。 通過比較組合抗生素處理前后微小亞歷山大藻的生長和產(chǎn)毒狀況，發(fā)現(xiàn)帶菌 藻培養(yǎng)液中細菌數(shù)量與藻的生長呈負相關(guān)。組合抗生素處理后，微小亞歷山大藻 的生長速率、最大細胞密度比帶菌藻明顯降低，穩(wěn)定期的維持時間也變短。在毒 素產(chǎn)生方面，抗生素處理藻的毒素含量有所降低，但毒素組成并沒有明顯變化。 總之，本文通過探討營養(yǎng)物質(zhì)和細菌等對微小亞歷山大藻生長和毒素產(chǎn)生的 影響，闡明了微小亞歷山大藻對不同類型營養(yǎng)物質(zhì)利用狀況的差異，以及藻細胞 毒性相應(yīng)的變化情況；初步探討了細菌對甲藻生長和毒素產(chǎn)生的影響，建立了組 合抗生素處理制備無菌藻的方法，并首次嘗試將甲藻孢囊誘導(dǎo)應(yīng)用于無菌藻的制 備，這為探討有毒甲藻赤潮的發(fā)生機制及毒素產(chǎn)生機理提供了相應(yīng)的科學(xué)依據(jù)。
【圖文】：

C圖 4. PSP 毒素的 PHLC 柱后衍生分析的色譜圖A: GTX1/4 標(biāo)準(zhǔn)毒素 B: GTX2/3 標(biāo)準(zhǔn)毒素 C: A. minutum 藻毒素Fig.4 The chromatograms of HPLC methods developed for PSP toxinsanalysis with post column deriveitizationA: GTX1/4 standard toxin B: GTX2/3 standard toxin C: toxin of A. minutum微小亞歷山大藻能夠產(chǎn)生四種麻痹性貝毒毒素，分別為 GTX1，GTX2，GTX3和 GTX4。其中 GTX1 和 GTX4 在 1 位 N 上的取代基為羥基，屬 N-OH 類毒素，而 GTX2 和 GTX3 在 1 位 N 上的取代基為氫，，屬于 N-H 類毒素。而 GTX1 和GTX4，GTX2 和 GTX3 又分別是空間異構(gòu)體，根據(jù)空間構(gòu)型的差別可以將 GTX1和 GTX2 歸為α異構(gòu)體，GTX3 和 GTX4 歸為β異構(gòu)體。從圖 4 可以看出，GTX1/4標(biāo)準(zhǔn)毒素的中 GTX4 的色譜峰的保留時間為 6.55 分鐘，GTX1 為 8.02 分鐘；

16. 微小亞歷山大藻的藻液中細菌 DNAPCR 產(chǎn)物瓊脂糖凝膠（其中 B：空白；C：對照 1 組；M：Marker）16 Agarose gel electrophoresis of the PCR amplification products DNA obtained form A. minutum culture medium(B: Blank C: control M: Marker)取的各組細菌 DNA 進行 PCR 擴增后的電泳圖如圖 16，空白100bp 的條帶，這是引物帶。Marker 為 DNAMarker DL2000（TaK 100bp、250bp、500bp、750bp、1000bp、2000bp DNA 片段，每條帶的 DNA 量約為 50ng。對照組的兩個平行均在大約 20的條帶，這就是引物 1 和 2 PCR 擴增出來的大約 200bp 左右 基因片段；而 A1 組、B1 組、A2 組、B2 組、A3 組和 B3 組均B C C A1 A1 B1 B1 A2 B2 A3 A3 B3 B3 M
【學(xué)位授予單位】：中國科學(xué)院研究生院（海洋研究所）
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2004
【分類號】：X55

【參考文獻】

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本文編號：2667457