【摘要】：隨著人們對海洋資源的開發(fā)利用,海洋生物污損所造成的損失越來越嚴重,研究開發(fā)對環(huán)境無毒無害、高效的傳統(tǒng)毒性涂料替代品成為人們關(guān)注的話題。海洋中的污損生物種類繁多,其中藤壺是海洋污損生物中最具代表性的一種,對環(huán)境有較強的適應性,是海洋污損生物的重要物種。目前尋找無毒抗污損活性化學品的研究已廣泛開展,基于的原理有抑制附著、抑制變態(tài)、干擾神經(jīng)或傳導等。本文針對網(wǎng)紋藤壺幼蟲的附著變態(tài)問題,首先通過實驗室模擬的方法,建立實驗室幼蟲附著變態(tài)測試模型。包括尋找出幼蟲的最適生長環(huán)境,對幼蟲的附著變態(tài)進行初步的研究。其次,利用前期研究發(fā)現(xiàn)的從海洋放線菌Streptomyces fungicidicus的代謝產(chǎn)物中分離鑒定出兩個flavone類化合物,測定了其抗藤壺幼蟲附著的活性,并驗證該活性測試模型。結(jié)果表明,genistein具有較好的抗幼蟲附著活性。同時,驗證實驗還發(fā)現(xiàn)mizolastine的功能類似物(H1受體拮抗劑)對幼蟲的附著變態(tài)有一定的影響。所以,本文主要從mizolastine的功能類似物著手,進行抗幼蟲附著變態(tài)的實驗研究,篩選出最優(yōu)的抗污損活性化合物,闡明組胺在藤壺幼蟲附著變態(tài)中的作用。本文的主要研究結(jié)果如下：(1)實驗室研究發(fā)現(xiàn),網(wǎng)紋藤壺適合生長在水溫約22℃以上的環(huán)境中,溫度過低時,不利于網(wǎng)紋藤壺的繁殖和生長。網(wǎng)紋藤壺產(chǎn)卵受精后,受精卵發(fā)育到無節(jié)幼蟲后才能完成孵化,無節(jié)幼蟲的個體較小,對環(huán)境的適應能力相對較差。實驗室中,通過不同環(huán)境的比較,選出適于無節(jié)幼蟲(nauplii)的生長環(huán)境,使無節(jié)幼蟲(nauplii)變態(tài)為金星幼蟲(cyprid)在約6d內(nèi)完成,該過程在恒溫環(huán)境(28℃±1℃)中進行,用角毛藻喂養(yǎng)。(2)根據(jù)前期實驗發(fā)現(xiàn)的mizolastine可以阻止藤壺生物幼蟲的附著變態(tài),根據(jù)其作為組胺信號分子受體拮抗劑的功能,篩選出35種信號分子受體干擾物質(zhì),并對此35種信號干擾物質(zhì)進行幼蟲的附著變態(tài)實驗。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)了8種優(yōu)良的無毒的抗污損活性化合物,在2.5μg ml-1濃度下可完全抑制幼蟲的附著變態(tài)。它們分別是：Loratadine、Ondansetron hydrochloride、Antazoline hydrochloride、Clemastine fumarate、Triprolidine hydrochlorise、 Azelastine hydrochloride、Propranolol hydrochloride和Clorprenaline hydrochloride。這些優(yōu)良的無毒抗污損活性化合物的抗污損效果接近或超過現(xiàn)實應用的傳統(tǒng)毒性抗污損化合物,而毒性低于傳統(tǒng)毒性抗污損化合物10-100倍。除了此8種優(yōu)選物質(zhì)外,還有4種活性較強的(Risperidone、Ketotifen fumarate、Tegaserod maleate和Clenbuterol hydrochloride)和6種有一定活性的抗污損活性化合物(Amitriptyline hydrochloride、Promethazine hydrochloride、Phenylephrine hydrochloride、Phentolamine Mesylate、Diphenhydramine hydrochloride和Lafutidine),它們分別可以在5μg ml-1及5-10μgml-1濃度下完全抑制幼蟲附著。從實驗中發(fā)現(xiàn),8種最優(yōu)抗污損活性化合物中有5種為組胺H1受體拮抗劑(Loratadine、Antazoline hydrochloride、Clemastine fumarate、 Triprolidine hydrochlorise和Azelastine hydrochloride),故推測活性產(chǎn)生的原因可能和干擾histamine信號途徑有關(guān)系。(3)8種最優(yōu)的抗污損活性化合物的深入研究。針對8種最優(yōu)的抗污損活性物質(zhì),進行了不同濃度處理條件下的幼蟲附著變態(tài)情況的研究。根據(jù)不同濃度下的幼蟲附著變態(tài)受抑制程度和處理濃度的關(guān)系,計算出每個樣品的EC50值。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn),此8種活性物質(zhì)的EC50分別為：Loratadine:EC500.625 μgml-1; Ondansetron hydrochloride:EC50=1.52μg ml-1; Antazoline hydrochloride:EC500.625μg ml-1; Clemastine fumarate:EC500.2μg m-1; Triprolidine hydrochlorise:EC50=O.91μg ml-1; Azelastine hydrochloride:EC50O.2 μgml-1; Propranolol hydrochloride:EC50=0.73μg ml-1; Clorprenaline hydrochloride:EC50=0.72μg ml-1。實驗中發(fā)現(xiàn)這些樣品在20μg ml-1的濃度下對幼蟲的致死率幾乎沒明顯貢獻,說明這些化合物為高效低毒的具有應用潛力的抗污損活性化合物。(4)驗證histamine參與幼蟲的附著變態(tài)的信號傳導。由于前述實驗發(fā)現(xiàn)多個組胺受體的拮抗劑高效抑制幼蟲的附著變態(tài),所以,本文還對組胺是否參與幼蟲的附著變態(tài)進行了驗證。驗證內(nèi)容主要分成三個部分：第一,正常狀態(tài)的幼蟲體內(nèi)是否含有組胺,這也是組胺參與幼蟲生理活動的物質(zhì)基礎；第二,外源添加組胺是否可以促進幼蟲的附著變態(tài)過程；第三,原本受信號干擾物質(zhì)關(guān)閉組胺信號通路的幼蟲,在新鮮環(huán)境中或增加histamine信號強度,可否完成附著變態(tài)過程。通過HPLC-Fr分析發(fā)現(xiàn),在nauplii幼蟲和cyprid幼蟲體內(nèi)均含有histamine，，因此這兩種不同發(fā)育階段的幼蟲均有了使用histamine作為信號傳遞載體的物質(zhì)基礎。在nauplii幼蟲變態(tài)為cyprid幼蟲的過程中,外源添加10-8、10-10、 10-12mol/L的histamine均可以有效減短培育時間,并提高變態(tài)率。其中,10-10mol/L的濃度處理效果最為顯著。而且本文培養(yǎng)了一種低能量的cyprid幼蟲,由于自身存儲的能量較少,原本能完成正常的附著變態(tài)的能力較弱。通過外源加入histamine,發(fā)現(xiàn)加入的組胺可促進幼蟲的附著變態(tài)。添加的histamine的最適濃度為5×10-9mol/L,高于或低于這一濃度時,對幼蟲附著變態(tài)的促進作用明顯減弱。最后,本文還設計了一種恢復實驗,即先用組胺受體拮抗劑抑制組胺信號,發(fā)現(xiàn)幼蟲不能完成附著變態(tài)過程；然后將處理的幼蟲清洗后,分成兩組放入含有5 ×10-9 mol/L histamine或新鮮海水中,比較在新環(huán)境中的幼蟲完成附著變態(tài)的情況。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn),histamine可有效解除原本histamine信號關(guān)閉的幼蟲不能附著變態(tài)的情況。所以,本文三方面的證據(jù)驗證了histamine參與幼蟲的附著變態(tài)的信號傳遞。本論文的研究結(jié)果表明,抗組胺物質(zhì)是良好的抗海洋生物污損化學物的候選品,并證明了組胺存在于藤壺幼蟲的體內(nèi),并參與其附著變態(tài)過程的信號傳遞。
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【學位授予單位】：揚州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：X55

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本文編號：2383594