【摘要】：本論文利用宏基因組測(cè)序的方法,探究了深圳大梅沙海域暴發(fā)的血紅哈卡藻(Akashiwo sanguinea)赤潮衰退期海水中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化情況,從中分離篩選出幾株高效溶藻菌菌株,并進(jìn)行溶藻特性檢測(cè)、溶藻物質(zhì)分離提取及溶藻菌VBNC狀態(tài)轉(zhuǎn)換等研究,獲得如下研究結(jié)果:(1)連續(xù)四天采集2014年6月中旬的深圳大梅沙赤潮衰退期海水,并對(duì)其葉綠素含量、可培養(yǎng)細(xì)菌數(shù)和細(xì)菌總數(shù)變化進(jìn)行了檢測(cè),發(fā)現(xiàn)在整個(gè)赤潮衰退期葉綠素含量持續(xù)下降,但在赤潮衰退的后期,海水中的細(xì)菌總數(shù)和可培養(yǎng)細(xì)菌數(shù)有一個(gè)突增的過(guò)程;通過(guò)0.22μm的水系濾膜收集水樣中的細(xì)菌DNA,利用宏基因組測(cè)序,分析此次赤潮衰退過(guò)程中的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)動(dòng)態(tài)變化,結(jié)果表明赤潮衰退期開(kāi)始階段細(xì)菌群落多樣性較高,優(yōu)勢(shì)類(lèi)群為變形菌門(mén)(Proteobacteria)中的γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria);而赤潮衰退期中間階段厚壁菌門(mén)(Firmicutes)所占比例有明顯上升,α變形菌綱和β變形菌綱和也成為優(yōu)勢(shì)門(mén)類(lèi);到了赤潮衰退末期主要優(yōu)勢(shì)門(mén)類(lèi)以γ-變形菌綱為主,尤其是其中的弧菌屬(Vibrio)和假交替單胞菌屬(Pseudoalteromonas);赤潮衰退期海水細(xì)菌數(shù)目和群落結(jié)構(gòu)的變化情況為進(jìn)一步了解赤潮生消過(guò)程中的藻菌關(guān)系提供了基礎(chǔ);(2)從深圳大梅沙海域赤潮水樣中分離獲得多株溶藻菌,其中具有較強(qiáng)溶藻效果的菌株D84-1經(jīng)16S r DNA方法鑒定其為弧菌屬(Vibrio),這與弧菌屬是赤潮衰退期中的優(yōu)勢(shì)菌屬結(jié)果一致,表明有強(qiáng)溶藻效果的弧菌屬可能在赤潮快速衰退過(guò)程中起重要作用;(3)以有毒海洋卡盾藻(Chattonella marina)為實(shí)驗(yàn)藻種,檢測(cè)了D84-1的溶藻方式,并對(duì)其溶藻譜進(jìn)行了測(cè)試,結(jié)果表明D84-1為間接溶藻,主要活性成分由細(xì)胞分泌到上清液中,對(duì)血紅哈卡藻、海洋卡盾藻等在內(nèi)的10種赤潮藻和1種水華藍(lán)藻(銅綠微囊藻Microcystis aeruginosa)具有溶藻能力,具有溶藻廣譜性;海洋卡盾藻加入D84-1上清后葉綠素含量降低,丙二醛(Malondialdehyde,MDA)、過(guò)氧化物酶(Peroxidase,POD)和超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD)含量則明顯增加,說(shuō)明D84-1的溶藻作用使藻細(xì)胞的膜系統(tǒng)收到破壞,抗氧化系統(tǒng)產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng),活性氧代謝受到影響;在對(duì)D84-1胞外分泌物溶藻物質(zhì)提取的探索過(guò)程中,發(fā)現(xiàn)乙酸乙酯萃取物的溶藻活性較高,而正丁醇萃取物也有一定的溶藻效果,進(jìn)一步溶藻物質(zhì)分離分析仍在進(jìn)行中;(4)在溶藻菌D84-1的VBNC狀態(tài)轉(zhuǎn)換研究中,探索了低溫、寡營(yíng)養(yǎng)、陳海水等條件下溶藻菌D84-1進(jìn)入活的不可培養(yǎng)(VBNC)狀態(tài)或從這一休眠狀態(tài)復(fù)蘇所需的時(shí)間。結(jié)果表明在低溫寡營(yíng)養(yǎng)共同作用條件下,D84-1完全進(jìn)入VBNC狀態(tài)需要3 d,在陳海水誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)組中,溫度起到重要作用,4℃下D84-1能在6 d內(nèi)基本誘導(dǎo)進(jìn)入VBNC狀態(tài),而22℃下D84-1在12 d后只有80%被誘導(dǎo)進(jìn)入VBNC狀態(tài);在復(fù)蘇實(shí)驗(yàn)中,赤潮衰退期水樣相較于陳海水,能更快速誘導(dǎo)已經(jīng)進(jìn)入VBNC狀態(tài)的D84-1復(fù)蘇到正常狀態(tài),這與赤潮衰退期海水中細(xì)菌可培養(yǎng)數(shù)增加的結(jié)果一致。電鏡觀察表明兩種狀態(tài)下的細(xì)菌形態(tài)差異明顯,正常狀態(tài)下D84-1細(xì)胞長(zhǎng)度在1~2μm,呈桿狀,表面光滑,而VBNC狀態(tài)細(xì)胞長(zhǎng)度在1μm以下,中央有凹陷,細(xì)胞體積明顯縮小,形態(tài)由桿狀變成了橢球形。
[Abstract]:In this paper, macrogenome sequencing was used to study the changes of bacterial community structure in the seawater during the red tide recession of Akashiwo sanguinea in Dameisha waters of Shenzhen. Several algae-lysing bacteria with high efficiency were isolated and screened out. The characteristics of algae-lysing bacteria were tested, the algae-lysing substances were isolated and extracted, and the VBNC status of algae-lysing bacteria was changed. The results are as follows: (1) The chlorophyll content, the number of culturable bacteria and the total number of bacteria in the red tide recession period of Dameisha in Shenzhen in June, 2014 were detected. It was found that the chlorophyll content decreased continuously during the whole red tide recession period, but in the late period of red tide recession, the fine content of the sea water was detected. The total bacterial count and the culturable bacterial count had a sudden increase process; the bacterial DNA in water samples was collected by 0.22 micron filter membrane, and the dynamic changes of bacterial community structure during the red tide recession were analyzed by macrogenome sequencing. The results showed that the diversity of bacterial community was higher at the beginning of the red tide recession, and the dominant group was Proteus (P Gamma Proteobacteria in roteobacteria, Firmicutes in the middle stage of red tide recession, and alpha Proteobacteria and beta Proteobacteria also became the dominant class; at the end of red tide recession, gamma Proteobacteria was the dominant class, especially Vibrio. And Pseudoalteromonas; the changes of bacterial number and community structure during the red tide recession provide a basis for further understanding the relationship between algae and bacteria in the process of red tide growth and disappearance; (2) A number of algae-lysing bacteria were isolated from the red tide water samples of Dameisha sea area in Shenzhen, and the strain D84-1 with strong algae-lysing effect was obtained by 16S R. DNA method identifies Vibrio, which is consistent with the result that Vibrio is the dominant bacteria in the red tide recession, indicating that Vibrio with strong algae-lysing effect may play an important role in the rapid red tide recession; (3) The toxic marine Chattonella Marina was used as the experimental algae species to detect the algae-lysis mode of D84-1 and to dissolve it. The results showed that D84-1 was an indirect algae-dissolving agent. The main active components were secreted from cells to supernatant. 10 species of red tide algae, including Hakazakia haematochrome and Cardanella marina, and one species of cyanobacteria (Microcystis aeruginosa) had algae-dissolving ability and broad-spectrum. Chlorophyll content decreased, malondialdehyde (MDA), peroxidase (POD) and superoxide dismutase (SOD) content increased significantly, indicating that the algae cell membrane system was damaged by the algae lysis of D84-1, the antioxidant system produced stress response, and the metabolism of reactive oxygen species was affected. In the process of extracting algae-lysing substances from algae secretion, it was found that ethyl acetate extract had higher algae-lysing activity, while n-butanol extract also had certain algae-lysing effect, and further separation and analysis of algae-lysing substances were still in progress. (4) In the study of VBNC state transition of algae-lysing bacteria D84-1, algae-lysing bacteria D under the conditions of low temperature, oligotrophic and aged sea The results showed that it took 3 days for D84-1 to fully enter the state of VBNC under the condition of low temperature oligotrophic interaction. Temperature played an important role in the induction experiment group of Chen Hai Hai. D84-1 could basically induce the state of VBNC within 6 days at 4 C and D84-1 could basically enter the state of VBNC at 22 C. In the resuscitation experiment, D84-1, which had already entered the VBNC state, could be induced to recover to the normal state more quickly than that of the old sea water, which was consistent with the increase of bacterial culturable number in the sea water during the red tide recession. Obviously, the length of D84-1 cells in normal state is 1-2 micron, rod-like, and the surface is smooth. In VBNC state, the length of D84-1 cells is less than 1 micron, the center has a depression, the cell volume is obviously reduced, and the morphology changes from rod-like to ellipsoid.
【學(xué)位授予單位】：深圳大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：X55;Q93

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本文編號(hào)：2224331