【摘要】：海洋環(huán)境中的溶藻細菌是一類對海洋微藻的生長具有抑制作用,或直接殺死藻細胞的細菌。研究溶藻細菌的功能與機制是藻菌作用關(guān)系的熱點問題,對探討赤潮的生物治理等關(guān)鍵科學問題具有重要的指導意義。本文以一株微藻共棲細菌Ponticoccus sp.PD-2為研究對象,研究了其群體感應系統(tǒng),利用CRISPR/CAS9技術(shù)成功敲除群體感應基因zlaI和zlbI,探明了其抑藻活性和群體感應之間的聯(lián)系,主要研究內(nèi)容包括:本文對PD-2的基因組序列進行分析,發(fā)現(xiàn)了兩對群體感應基因(luxI/R同源基因),命名為zlaI/R和zlbI/R。通過構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹和多重蛋白序列比對分析,發(fā)現(xiàn)這兩對群體感應調(diào)控蛋白與其他菌種對應蛋白的同源性較高,高于69%,且luxI同源蛋白的氨基酸序列高度保守。利用生物傳感器和GC-MS檢測PD-2產(chǎn)生的AHLs信號分子的數(shù)量和種類,發(fā)現(xiàn)該菌至少可以產(chǎn)生兩種AHLs分子,分別為OC8-HSL和OC10-HSL。分別克隆zlaI和zlbI基因并連接表達栽體pGEX-6P-1,在大腸桿菌E.scherichia coli BL21中高效異源表達,生物自顯影的方法證實兩個luxI同源基因均能合成OC8-HSL和OC10-HSL兩種信號分子,其中OC8-HSL主要由zlbI調(diào)控合成。本文通過抑藻實驗發(fā)現(xiàn),PD-2的代謝產(chǎn)物對三種赤潮藻(東海原甲藻,棕囊藻,塔瑪亞歷山大藻)的生長有明顯的抑制作用,對其宿主東海原甲藻的抑制作用最強。我們通過向PD-2培養(yǎng)液中加入AHLs信號分子抑制劑β-環(huán)糊精后,發(fā)現(xiàn)PD-2信號分子的含量明顯減少。通過抑藻實驗發(fā)現(xiàn),AHLs信號分子減少后PD-2的藻活性也降低了50%-80%,說明淬滅QS系統(tǒng)后可以影響PD-2中抑藻物質(zhì)的產(chǎn)生。本論文利用CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng),成功敲除了PD-2中的兩個AHLs合成酶基因zlaI和zlbI,實現(xiàn)了CRISPR/CAS9在海洋細菌中的應用。后對PD-2zlaI和zlbI缺失突變體進行了AHLs分子及抑藻活性檢測,實驗結(jié)果表明敲除luxI同源基因的PD-2不再產(chǎn)生AHLs信號分子,同時其抑藻功能消失,該結(jié)果進一步從分子水平證明了PD-2的抑藻活性受群體感應系統(tǒng)的調(diào)控。
[Abstract]:Algae-lysing bacteria in marine environment are a kind of bacteria which can inhibit the growth of marine microalgae or kill the algal cells directly. The study of the function and mechanism of algae-lysing bacteria is a hot issue in the relationship between algal bacteria and algal bacteria. It is of great significance to discuss the key scientific issues such as the biological treatment of red tide. In this paper, the colony sensing system of Ponticoccus sp. PD-2, a microalgae eutrophic bacterium, was studied. The relationship between its anti-algal activity and colony induction was investigated by using CRISPRR / CAS9 technique to successfully knockout the genes ZlaI and zlbI. The main research contents are as follows: in this paper, we analyzed the genome sequence of PD-2 and found two pairs of colony sensing genes (luxIr / R homologous genes) named zla I / R and zlbi / r / r. By constructing phylogenetic tree and analyzing the sequence alignment of multiplex proteins, it was found that the homology of these two pairs of proteins was higher than 69, and the amino acid sequences of luxI homologous proteins were highly conserved. The number and type of AHLs produced by PD-2 were detected by biosensor and GC-MS. It was found that the bacteria could produce at least two kinds of AHLs, namely OC8-HSL and OC10-HSL. The zla I and zlbI genes were cloned and ligated into the expression plant pGEX-6P-1, which was highly expressed in E. scherichia coli BL21. The biosynthesis of OC8-HSL and OC10-HSL showed that both luxI homologous genes could synthesize OC8-HSL and OC10-HSL, and OC8-HSL was mainly regulated by zlbI. In this paper, we found that the metabolites of PD-2 had obvious inhibitory effects on the growth of three species of red tide algae (Prorocentrum, Phaeocystis and Alexandrium tamaranopyrium), and had the strongest inhibitory effect on the host Prorocentrum of the East China Sea. After adding AHLs signal molecule inhibitor 尾 -cyclodextrin to PD-2 medium, we found that the content of PD-2 signal molecule decreased significantly. The algal activity of PD-2 was also decreased by 50% -80% after the decrease of AHLs signaling molecule, which indicated that quenching QS system could affect the production of algal inhibitor in PD-2. In this paper, the CRISPRR / Cas9 gene editing system was used to successfully knock out the two AHLs synthase genes ZlaI and zlbIfrom PD-2, and to realize the application of CRISPRP / CAS9 in marine bacteria. The AHLs and anti-algal activity of PD-2zla I and zlbI deletion mutants were detected. The results showed that PD-2 of the knockout luxI homologous gene no longer produced AHLs signaling molecules, and its anti-algal function disappeared. The results further demonstrated that the inhibitory activity of PD-2 was regulated by population sensing system at molecular level.
【學位授予單位】：國家海洋局第一海洋研究所
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：Q78;X55

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本文編號：2127604