本文關(guān)鍵詞：一株海綿共生芽孢桿菌的抗硅藻附著活性物質(zhì)的分離與鑒定　出處：《揚州大學》2015年碩士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】：海洋微生物由于其特殊的海洋生存環(huán)境,能產(chǎn)生結(jié)構(gòu)新穎且活性多樣的代謝產(chǎn)物,從其中尋求具有特異活性的天然產(chǎn)物是開發(fā)海洋資源的重要研究方向。海洋生物污損是一直是困擾人類的棘手難題,現(xiàn)行的防污措施都只是臨時尋找對環(huán)境危害相對較小的化合物進行防治,沒有從根本上解決問題。開發(fā)高效、無毒、環(huán)境友好的活性化合物,是目前國內(nèi)外公認解決途徑。越來越多的證據(jù)表明,海綿獨特的防污損化學機制,很有可能來源于其共附生的微生物。因此,從海綿共附生微生物中尋找天然抗污損活性物質(zhì),是解決海洋生物污損的重要且可行的方案。本研究針對一株海綿共附生細菌UST050418-715菌株,進行了抗硅藻附著活性的測定、菌種鑒定、發(fā)酵條件優(yōu)化、細菌發(fā)酵、活性指導下的活性化合物分離和結(jié)構(gòu)鑒定。結(jié)果如下：(1)試驗菌株的篩選與菌種鑒定實驗室前期工作已經(jīng)篩選出有抗硅藻附著活性的海綿共附生細菌,選取其中4株：UST050418-315、UST050418-69、UST050418-708和UST050418-715,進行三種硅藻(小新月菱形藻、、咖啡雙眉藻、碎片菱形藻)的活性驗證。結(jié)果表明,這4株測試細菌均對三種附著硅藻(小新月菱形藻(Nitzschia closterium)、咖啡雙眉藻(Amphora cofeaeformis)和碎片菱形藻(Nitzschia frustulum))有明顯的抑制作用,平均抑制率都超過90%。其中菌株UST050418-715對三種附著硅藻都有較強的抑制附著作用,對測試硅藻的抑制率均≥90%,平均抑制率達92.1%,因此選定試驗菌株為UST050418-715。通過16S rDNA的測序分析,結(jié)合平板的菌落形態(tài)和掃描電鏡下菌體特征,鑒定菌株UST050418-715為短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)。(2)菌株UST050418-715發(fā)酵條件優(yōu)化針對菌株UST050418-715進行了四因素三水平的正交試驗,發(fā)現(xiàn)這四種因素對發(fā)酵結(jié)果影響從大到小的順序依次：酵母粉蛋白胨NaClpH。通過正交試驗,結(jié)合菌株發(fā)酵粗提物活性、粗提物產(chǎn)量和菌株生長情況進行綜合分析,發(fā)現(xiàn)各發(fā)酵條件對活性物質(zhì)產(chǎn)量有極顯著的影響,因此結(jié)合三個指標測定結(jié)果確定了菌株UST050418-715的最佳發(fā)酵條件為：蛋白胨濃度為7.5 g/L,酵母粉濃度為3 g/L,NaCl濃度為10.45 g/L,pH 9.5。(3)菌株UST050418-715活性物質(zhì)的分離和結(jié)構(gòu)鑒定對菌株UST050418-715進行發(fā)酵,積累粗提物。以抗硅藻附著的活性為導向,對粗提物進行逐步的分離純化和結(jié)構(gòu)鑒定。分離步驟：1)初步分離：用不同溶劑萃取將粗提物按照極性大小分為5個組分,石油醚相、二氯甲烷相、乙酸乙酯相、正丁醇相和水相,分別記為Fr-1～Fr-5.用顯微計數(shù)測定5個組分的抗硅藻附著活性,HPLC分析各組分,其中二氯甲烷相(Fr-2)活性最好,乙酸乙酯相極性適中易于分離。2)半制備色譜分離：用恒定40%的甲醇作流動相洗脫分離Fr-3,得到Fr-3.1～Fr-3.7,其中Fr-3.2*、Fr-3.5*、Fr-3.6、Fr-3.7*較純,Fr-3.3活性較好。用40%的甲醇洗脫Fr-2進行半制備HPLC分離,得到Fr-2.1-Fr-2.8,其中Fr-2.1、Fr-2.3*、Fr.2.5*較純,Fr-2.4、Fr-2.6、Fr-2.7、Fr-8有較好的活性。3)半制備HPLC進一步分離：對活性較好的組分：Fr-3.3、Fr-2.4、Fr-2.6和Fr-2.7進一步的半制備HPLC分離,得到Fr-3.3.1～Fr-3.3.8。Fr-2.4.1～Fr.2、4.6、Fr-2.6.1～Fr-2.6.6和Fr-2.7.1～Fr.2.7.3.進一步分離Fr-2.6.2,得到Fr.2.6.2.1～Fr-2.6.2.4.通過以上分離,選取較純或活性較好的34個組分進行GC-MS分析,其中12個組分較純,對其進行1H-NMR分析。通過GC-MS的分子質(zhì)量分析和1H-NMR分析,可以鑒定出Fr-2.3*、Fr-2.4.2和Fr-3.5*的主要成分為同種物質(zhì),環(huán)(L-亮氨酸-L-脯氨酸)[Cyclo(L-Leu-L-Pro)],其抑制率分別為12.7%±8.4%、28.5%±3.5%和30.7%±5.0%；Fr-2.4.3的平面結(jié)構(gòu)為環(huán)(纈氨酸-脯氨酸)[Cyclo(Val-Pro)],其抑制率為28.0%±10.4%；Fr-2.6.5為壞(D-脯氨酸-L-亮氨酸)[Cyclo(D-Pro-L-Leu)],其抑制率為28.0%±12.6%;Fr-2.7.1為環(huán)(L-脯氨酸-D-亮氨酸)[Cyclo-(L-Pro-D-Leu)],其抑制率為18.0%±2.8%；Fr-3.2*為環(huán)(甘氨酸-D-脯氨酸)[Cyclo-(Gly-D-Pro)],其抑制率為46.3%±10.8%;Fr-3.6為環(huán)(4R-D-羥脯氨酸-L-苯丙氨酸)[Cyclo(4R-D-Hydroxypro-L-Phe)],其抑制率為28.7%±11.3%；Fr-3.7*為環(huán)(4R-L-羥脯氨酸-L-苯丙氨酸)[Cyclo(4R-L-Hydroxypro-L-Phe)],其抑制率為11%±5.5%。
[Abstract]:In order to solve the problem of marine biological fouling , we have selected four strains : UST050418 - 315 , UST050418 - 69 , UST050418 - 708 and UST050418 - 715 . ( 2 ) The optimal fermentation conditions of strain UST050418 - 715 were optimized for strain UST050418 - 715 . The results showed that the optimum fermentation conditions were : peptone concentration 7.5 g / L , yeast powder concentration 3 g / L , NaCl concentration 10.45 g / L and pH 9.5 . ( 3 ) Separation and structure identification of the active substances of the strains UST050418 - 715 were carried out on the strains UST050418 - 715 . The crude extracts were separated and purified by HPLC .

【學位授予單位】：揚州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：X55;X172

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