miRNA是一類非編碼小RNA,在癌癥細(xì)胞中表達(dá)異常,常作為癌癥的標(biāo)志物。miRNAs常見的檢測(cè)方法有微陣列法,miRNA測(cè)序法,PCR。其中PCR是分子生物學(xué)研究的一種極其重要的工具,經(jīng)過多年研究,PCR從定性分析發(fā)展為定量分析。為了適用于復(fù)雜的實(shí)驗(yàn)場(chǎng)景,PCR儀的一個(gè)發(fā)展方向是設(shè)備的便攜化,PCR儀便攜化的關(guān)鍵是PCR微流控技術(shù)。PCR微流控技術(shù)分為空間域PCR和時(shí)間域PCR,空間域PCR技術(shù)反應(yīng)時(shí)間短、和上下游模塊易組合的優(yōu)勢(shì),吸引了研究者的興趣。PCR微流控芯片傳統(tǒng)制備技術(shù)以軟光刻為主,操作復(fù)雜、制備時(shí)需要大型儀器、技術(shù)要求高等缺點(diǎn)制約了它的進(jìn)一步發(fā)展。近年來,一種新的微流控制備技術(shù)3D打印技術(shù)開始應(yīng)用于微流控芯片的制備,它的制備過程基本上不需要人工操作,操作簡(jiǎn)單,并且成本比較低。但是,使用3D打印技術(shù)制備PCR微流控芯片的研究較少。本文基于以上研究現(xiàn)狀,采用3D打印技術(shù)制備液滴PCR微流控芯片,并制備便攜式液滴PCR儀,檢測(cè)癌癥細(xì)胞中的miRNA。首先,本文設(shè)計(jì)了四種空間域PCR芯片,探究微流控通道的形狀和尺寸設(shè)計(jì),初步實(shí)驗(yàn)表明電熱蛇型PCR芯片具有加熱快、加熱元件形狀易加工、可設(shè)置多個(gè)循環(huán)等優(yōu)勢(shì),所以選用該芯片進(jìn)行后續(xù)研究。進(jìn)一步計(jì)算PCR實(shí)驗(yàn)時(shí)微流控芯片通道流量,探究持續(xù)相和分散相不同流量下液滴的生成性能,實(shí)現(xiàn)小的液滴生成。為了在較短時(shí)間內(nèi)完成PCR實(shí)驗(yàn),選定持續(xù)相23μL/min,分散相1μL/min為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的流量設(shè)置。然后,本文構(gòu)建了PI加熱膜控溫系統(tǒng)、加熱陶瓷控溫系統(tǒng)、筒式加熱器控溫系統(tǒng),探究3D打印的PCR微流控芯片在同一流量設(shè)置時(shí),三種控溫系統(tǒng)下芯片的溫度分布情況。對(duì)三種控溫系統(tǒng)下芯片的溫度分布進(jìn)行紅外圖像處理,溫度值分析后,筒式加熱器較快的加熱速度,良好的均一性和穩(wěn)定性的特點(diǎn),有利于PCR實(shí)驗(yàn)成功。因此選用筒式加熱器控溫系統(tǒng)進(jìn)行下一步液滴PCR實(shí)驗(yàn)。最后,在3D打印制備的便攜式液滴PCR儀上進(jìn)行PCR實(shí)驗(yàn)。實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)菌Lacz基因中100 bp片段的擴(kuò)增,進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)得出3D打印技術(shù)制備的便攜式液滴PCR儀靈敏度為1 ng/μL。對(duì)MCF-7乳腺癌細(xì)胞的miRNA-21進(jìn)行擴(kuò)增,驗(yàn)證miRNA-21在便攜式液滴PCR儀上的擴(kuò)增,并且筒式加熱器高溫區(qū)域溫度設(shè)置為105℃,低溫區(qū)域溫度設(shè)置為60℃時(shí)有最佳實(shí)驗(yàn)結(jié)果。擴(kuò)增MCF-10A正常細(xì)胞和MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞的miRNA-21,凝膠電泳分析擴(kuò)增產(chǎn)物,通過miRNA-21表達(dá)量的不同檢測(cè)出MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞。綜上所述,3D打印技術(shù)制備的便攜式液滴PCR儀成功實(shí)現(xiàn)了液滴PCR,并且檢測(cè)出癌癥細(xì)胞中的miRNA。不僅證明了3D打印技術(shù)制備PCR微流控芯片的可行性,并且實(shí)現(xiàn)了PCR儀的微型化。采用3D打印制備便攜式液滴PCR儀,還體現(xiàn)了3D打印技術(shù)的個(gè)性化制作、一體成型等優(yōu)勢(shì)。在下一步的研究中,我們將對(duì)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步的優(yōu)化,增加熒光檢測(cè)模塊實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)檢測(cè)和分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。同時(shí),拓展PCR儀的應(yīng)用場(chǎng)景,發(fā)揮它的巨大優(yōu)勢(shì)。相信在未來,3D打印技術(shù)制備的便攜式液滴PCR儀在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用。
【學(xué)位單位】：西安電子科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：TN492;TP391.73;R730.43
【部分圖文】：

脊椎動(dòng)物、無脊椎動(dòng)物和植物中進(jìn)化保守，這說明它們。miRNA 由單個(gè)基因轉(zhuǎn)錄而成，存在基因之間或在蛋白顯子基因中[3]。miRNAs 在組織中特異性表達(dá)，組織中 疾病的狀況相關(guān)。成主要是前體 miRNA 的成熟、成熟 miRNA 組裝成微目標(biāo) mRNA 的翻譯來控制蛋白質(zhì)編碼基因的表達(dá)[4]，如iRNA通過RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄為較長的帶帽初級(jí)miRN內(nèi)切核糖核酸酶 III Drosha 酶和 DGCR8 在細(xì)胞核內(nèi)將 酸長的中間莖環(huán)結(jié)構(gòu)前體 miRNA（pre-miRNA）[7]。Prtin-5 協(xié)助下從細(xì)胞核主動(dòng)運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞質(zhì)，其次使用 RNr 蛋白，雙鏈反式激活響應(yīng) RNA 結(jié)合蛋白處理 pre-miR小雙鏈 RNA 結(jié)構(gòu)[8][9]。雙鏈的 miRNA 被展開成為成熟NA 誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物 RISC 上，復(fù)合物導(dǎo)入靶 miRNA13]，開放讀碼框架和啟動(dòng)子區(qū)域[14]。

[29]。這些短 RNA 靶標(biāo)擴(kuò)增非常困難，微陣列特異性較低會(huì)導(dǎo)致假陽性。圖1.2 微陣列法檢測(cè) miRNAs[29]另一方面，miRNA 的特性影響微陣列技術(shù)在 miRNA 表達(dá)分析中的應(yīng)用。主要有四個(gè)原因：第一，miRNA 長度很短，為優(yōu)化雜交效率提供的序列很少；第二，GC 的含量差異很大，導(dǎo)致雜交的特異性有很大差異；第三，一些 miRNA 的豐度較低；第四，密切相關(guān)的 miRNA 家族成員甚至在單個(gè)核苷酸上也存在差異。為了解決這些問

圖1.3 PCR 法檢測(cè) miRNA 原理[35][36]（a）polay（A）法（b）莖環(huán)法c. 液滴數(shù)字 PCRmiRNA 實(shí)現(xiàn)相對(duì)定量的主要問題在于缺乏通用和可靠的參考基因[37]。液滴數(shù)字PCR（Droplet digital PCR，ddPCR）使用液滴發(fā)生裝置，將 PCR 樣品分散到 2000個(gè) nL 級(jí)別的液滴中。PCR 擴(kuò)增在每個(gè)單獨(dú)的液滴中發(fā)生，并且里面的 PCR 實(shí)驗(yàn)流程和基于 TaqMan 探針的實(shí)時(shí) PCR 類型相似。當(dāng) PCR 擴(kuò)增完成后，讀取液滴中 PC結(jié)果為陽性的部分。在泊松分布的假設(shè)下對(duì)參加反應(yīng)的靶分子拷貝進(jìn)行計(jì)算[38]，如圖1.4 所示。ddPCR 的優(yōu)點(diǎn)是絕對(duì)定量，不需要額外的內(nèi)參基因，檢測(cè)低豐度靶標(biāo)的靈敏度更高，而且對(duì)擴(kuò)增反應(yīng)中抑制劑存在的耐受性有很大提升[39]。與 qRT-PCR 相比，ddPCR 在分析循環(huán) miRNA 方面的技術(shù)性能和診斷潛力均表現(xiàn)出明顯優(yōu)勢(shì)[40]。
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