發(fā)布時間：2020-03-27 21:42

【摘要】：體內(nèi)幾乎所有的細胞,都暴露于由各種細胞和復雜細胞外基質所組成的三維(three-dimensional,3-D)環(huán)境中。在一定程度上,細胞的特異性3-D排布,決定了所構成組織和器官的功能。在傳統(tǒng)的二維(two-dimensional,2-D)細胞培養(yǎng)體系中,細胞僅僅只能附著在平坦硬質的培養(yǎng)皿表面,缺乏細胞與細胞之間以及細胞與細胞外基質之間的相互作用,不能用來模擬復雜的3-D腫瘤結構的形成,也不能用來研究細胞與細胞外微環(huán)境間相互作用。因此,構建體外3-D實驗模型,更真實的反映體內(nèi)的組織環(huán)境,對于抗癌研究有非常重要的意義。3-D細胞培養(yǎng)模型,可以更真實地反映體內(nèi)實體腫瘤的三維空間結構。近些年來,各種各樣的三維細胞培養(yǎng)系統(tǒng)被研究者們所使用,但最受歡迎、最有效的模型就是多細胞腫瘤球。通過不同的技術手段可以獲得多細胞腫瘤球,相比于傳統(tǒng)的2-D細胞培養(yǎng)系統(tǒng)以及其它的多細胞腫瘤球獲取方法,利用微流控芯片技術獲取多細胞腫瘤球具有更顯著的優(yōu)勢。在本論文中,描述了一個穩(wěn)定可靠的微流控實驗裝置,基于微流控和微加工技術,成功的獲取了具有精確控制尺寸,大小均一以及可實時調整水凝膠基質組分的殼核式水凝膠細胞微球,為操控細胞及其微環(huán)境提供了更有效的平臺。為了更好地理解凝膠微球形成的機制,基于多相流數(shù)值模型,本研究利用COMSOL Multiphysics軟件對微液滴的生成過程以及流場的演化過程進行了數(shù)值模擬。仿真模擬結果觀察到了尺寸對流速的依賴性以及渦流對殼核式微球結構形成的影響,與實驗結果有很好的一致性。主要工作包括以下三個方面:(1)微流控芯片的設計和制作:利用L-edit軟件設計芯片的幾何結構,采用軟光刻技術以及表面等離子體鍵合技術等,制作了符合實驗要求的PDMS微流控芯片。此外,基于多相流數(shù)值模型,對所設計的微流控芯片中液滴生成的動力學過程進行數(shù)值仿真模擬,仿真結果證明了芯片設計結構的可行性,為后續(xù)芯片實驗操作提供了重要的參考依據(jù)。(2)水凝膠微球獲取:使用微流控芯片成功的獲取了大小尺寸均一的凝膠微液滴,實驗結果也驗證了仿真模擬結果的正確性。利用實驗方法和數(shù)值模擬方法,針對油相流速對液滴大小的影響進行了研究,實驗結果和數(shù)值仿真結果有很好的一致性。此外,在兩水相流速比變化的情況下,探究了芯片通道內(nèi)熒光強度的分布,證明了微流控芯片可以實時調整凝膠微球的基質組分。(3)包裹細胞的殼核式凝膠微球獲取:搭建了受控的低溫冷卻裝置,結合微流控芯片技術,成功的將腫瘤細胞包裹到殼核式的凝膠結構中。實驗發(fā)現(xiàn)油相O2的流速對殼核式結構的形成具有顯著的影響。利用COMSOL Multiphysics軟件,對液滴生成過程中變形液滴內(nèi)流場的演變過程進行了數(shù)值模擬,發(fā)現(xiàn)由于增大的油相速度使得水相受到了更大的壓力和剪切力的作用,導致流場產(chǎn)生了不穩(wěn)定的渦流。不穩(wěn)定渦流的出現(xiàn)破壞了異質的殼核分層結構,數(shù)值仿真結果和實驗結果有很好的一致性。異質的殼核式微球結構,為更好的模擬體內(nèi)細胞外微環(huán)境,以及觀察細胞和細胞外基質間相互作用提供了可能性。此外,通過標準的吖啶橙和碘化丙錠(AO/PI)雙染色法,對四種不同的水凝膠組分中癌細胞的增殖和活性進行了評估。
【圖文】：

研究提供了生物基礎[25]。Carey 等（2013）利用多細胞球共培養(yǎng)模型力強的惡性細胞會誘導原本正常上皮細胞發(fā)生侵襲，，并且這兩種細過程中始終表現(xiàn)出不同的領導者和追隨者角色；實驗結果表明腫瘤種亞群之間存在復雜的相互作用，并影響臨床結果[26]。Labernadie 等（結果表明，成纖維細胞會對癌細胞施加了一種物理作用力，即機械粘附，并引導癌細胞遷移以及促使腫瘤侵襲[27]。細胞腫瘤球（如圖 1.1），作為經(jīng)典的癌細胞 3-D 培養(yǎng)模型，可以更內(nèi)實體腫瘤的 3-D 空間組織結構[11, 28]。通常實驗獲取的多細胞腫瘤毫米大小，大多存在分層的異質性結構。最中心的“核”部分是由營養(yǎng)物質而形成的壞死的部分；中間層為休眠的細胞；而最外層細細胞，在侵襲時分化出高侵襲性的癌細胞。多細胞腫瘤球所形成的，為研究細胞亞群間、細胞與環(huán)境之間相互作用創(chuàng)造了實驗平臺，現(xiàn)了體內(nèi)腫瘤組織的異質性。腫瘤組織的 3-D 異質性結構，是無法 培養(yǎng)系統(tǒng)所能得到的。

流控芯片三種典型的微通道示意圖（a）流動聚焦型微通道；（（c）共軸流型微通道。Illustrations of the three main microfluidic geometries used for droplFlow focusing, (b) T-junction and (c) Co-flowing.控芯片進行凝膠細胞微球實驗，主要涉及到兩種生物相料和微流控芯片通道的材料。目前，可供選擇的用于細可分為兩大類：合成材料和天然材料。天然基質材料中Sodium alginate）、基質膠（Matrigel）、膠原 I（Colla；合成基質材料有聚已內(nèi)脂（PCL）、聚乙二醇（PE的制作材料有很多種，大致分為無機材料和有機聚合物、玻璃等無機材料；聚甲基丙烯酸甲酯、聚二甲基硅氧，聚二甲基硅氧烷，即 Poly(dimethyl siloxane)（PDMS流控系統(tǒng)中最常用的材料。PDMS 作為芯片的通道材性、可高溫高壓滅菌以及良好的透氣性等特征，為細胞
【學位授予單位】：重慶大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：TN492;R73-33

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本文編號：2603428