發(fā)布時(shí)間：2017-08-19 02:07

  本文關(guān)鍵詞：納米氧化鋅對(duì)NLRP3炎性小體的激活作用及機(jī)制

  更多相關(guān)文章： 納米氧化鋅 NLRP3炎性小體 活性氧 核轉(zhuǎn)錄因子-κB

【摘要】：背景納米氧化鋅(Zinc Oxide Nano-Particles,ZnO-NPs)是一種新型高功能無機(jī)精細(xì)產(chǎn)品,具有宏觀材料所不具備的表面效應(yīng)、量子尺寸效應(yīng)以及宏觀隧道效應(yīng)、高分散性等特點(diǎn),被廣泛應(yīng)用于陶瓷、化工、電子、光學(xué)、生物、醫(yī)藥、國防等許多領(lǐng)域。與此同時(shí),納米氧化鋅的毒性作用也受到了人們的廣泛關(guān)注。納米氧化鋅主要通過呼吸道進(jìn)入機(jī)體,由于其具有較小粒徑,可進(jìn)入到肺泡深部,誘導(dǎo)呼吸道上皮細(xì)胞活性氧(Reactive Oxygen Species,ROS)生成量增多,誘發(fā)炎性反應(yīng)。NLRP3(Nod-liker Recptor Protein 3,NLRP3)炎性小體是炎性反應(yīng)的重要組成部分,是由NLRP3分子、凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD,ACS)和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1(cysteine-requiring aspartate protease-1,caspase-1)組成的分子量約為700 k D的蛋白復(fù)合體,可以被ROS活化�；罨腘LRP3炎性小體可以切割炎性因子白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、IL-18前體,促進(jìn)其成熟釋放,從而誘導(dǎo)其他炎性因子的分泌,促進(jìn)炎性反應(yīng)的發(fā)展進(jìn)程。研究表明核轉(zhuǎn)錄因子(Nuclear Factor Kappa B,NF-κB)可以調(diào)控NLRP3炎性小體的活化,促進(jìn)炎性因子的分泌。然而,納米氧化鋅引發(fā)炎性反應(yīng)中NLRP3炎性小體是否被活化并發(fā)揮作用未見報(bào)道。本課題選用人肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞(A549)作為研究對(duì)象,以納米氧化鋅顆粒物(ZnO-NPs)作為刺激物,研究NLRP3炎性小體的活化在ZnO-NPs誘發(fā)A549細(xì)胞產(chǎn)生炎性反應(yīng)中的作用及機(jī)制。方法1、ZnO-NPs對(duì)A549細(xì)胞的脂質(zhì)過氧化作用:不同濃度(0、10、20、40μg/m L)ZnO-NPs刺激A549細(xì)胞4、8、24 h,染毒結(jié)束后收集各組細(xì)胞。應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞內(nèi)ROS平均熒光信號(hào)強(qiáng)度(Mean Fluorescence Intensity,MFI)來反映各組細(xì)胞內(nèi)ROS水平;應(yīng)用丙二醛(Malondialdehyde,MDA)試劑盒、超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD)活性檢測試劑盒分別檢測各組細(xì)胞內(nèi)MDA含量和SOD活性。2、ZnO-NPs對(duì)A549細(xì)胞內(nèi)NF-κB的活化作用:不同濃度ZnO-NPs刺激A549細(xì)胞24 h,染毒結(jié)束后收集各組細(xì)胞。應(yīng)用蛋白印跡法(Western Blot,WB)檢測細(xì)胞內(nèi)磷酸化p65的表達(dá)水平以反映細(xì)胞內(nèi)NF-κB的活化水平。3、ZnO-NPs對(duì)A549細(xì)胞內(nèi)NLRP3炎性小體的激活作用:不同濃度ZnO-NPs刺激A549細(xì)胞12 h,染毒結(jié)束后收集各組細(xì)胞,應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Real-time fluorescent quantitative Polymerase Chain Reaction,Real-time PCR)檢測NLRP3 m RNA的表達(dá)水平;ZnO-NPs刺激A549細(xì)胞24 h,染毒結(jié)束后收集各組細(xì)胞及培養(yǎng)上清,應(yīng)用Western Blot檢測細(xì)胞內(nèi)NLRP3、Caspase-1活性小亞基p10的蛋白表達(dá)水平;應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附法(Enzyme Linked Immuno-sorbent Assay,ELISA)檢測A549細(xì)胞培養(yǎng)上清中炎性因子IL-1β、IL-18的表達(dá)水平。4、抑制劑對(duì)通路的影響:4.1活性氧抑制劑N-乙酰半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine,NAC)對(duì)NF-κB、NLRP3炎性小體活化的影響:NAC預(yù)處理A549細(xì)胞后用ZnO-NPs刺激A549細(xì)胞24 h,染毒結(jié)束后收集各組細(xì)胞及培養(yǎng)上清。應(yīng)用Western Blot分別檢測各組細(xì)胞內(nèi)磷酸化p65、NLRP3、caspase-1活性小亞基p10的蛋白表達(dá)量;應(yīng)用ELISA檢測A549細(xì)胞培養(yǎng)上清中炎性因子IL-1β、IL-18的含量。4.2 NF-κB抑制劑BAY11-7082(BAY)對(duì)ROS、NLRP3炎性小體表達(dá)水平的影響:BAY11-7082預(yù)處理A549細(xì)胞后用ZnO-NPs刺激A549細(xì)胞8 h,染毒結(jié)束后收集各組細(xì)胞,應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞ROS的表達(dá)水平;BAY11-7082預(yù)處理A549后用ZnO-NPs刺激A549細(xì)胞24 h,染毒結(jié)束后收集各組細(xì)胞及培養(yǎng)上清,應(yīng)用Western Blot檢測各組細(xì)胞內(nèi)NLRP3、caspase-1活性小亞基p10的表達(dá)量;應(yīng)用ELISA檢測A549細(xì)胞培養(yǎng)上清中炎性因子IL-1β、IL-18的表達(dá)水平。4.3 NLRP3抑制劑格列本脲(Glibenclamide,GEL)對(duì)炎性因子IL-1β、IL-18的影響:GEL預(yù)處理A549細(xì)胞后用ZnO-NPs刺激A549細(xì)胞24 h,染毒結(jié)束后收集各組細(xì)胞培養(yǎng)上清,應(yīng)用ELISA分別檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清中炎性因子IL-1β、IL-18的含量。結(jié)果1、ZnO-NPs對(duì)A549細(xì)胞的脂質(zhì)過氧化作用:相同染毒劑量下,各組細(xì)胞ROS水平和MDA的含量隨著染毒時(shí)間的增加而升高,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);相同染毒時(shí)間下,隨著染毒劑量的增加,ROS水平與MDA含量也隨之增加,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。SOD的活性隨著染毒時(shí)間與劑量的增加呈下降趨勢,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。2、ZnO-NPs對(duì)A549細(xì)胞NF-κB活化水平的影響:WB結(jié)果顯示,0、10、20、40μg/m L劑量組磷酸化p65的相對(duì)表達(dá)水平分別為0.23、0.45、0.96、1.12;隨著染毒劑量的增加,NF-κB的活化水平呈現(xiàn)上升趨勢。3、ZnO-NPs對(duì)A549細(xì)胞NLRP3炎性小體活化的影響:3.1 ZnO-NPs對(duì)A549細(xì)胞NLRP3與caspase-1表達(dá)的影響:Real Time-PCR結(jié)果顯示NLRP3 m RNA的表達(dá)水平隨著染毒劑量增加而升高,各劑量組與對(duì)照組相比較,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。Western Blot結(jié)果表明,隨著染毒劑量的增加,NLRP3炎性小體與Caspase-1活性小亞基p10的蛋白表達(dá)水平也隨之升高。3.2 ZnO-NPs對(duì)A549細(xì)胞炎性因子IL-1β、IL-18表達(dá)水平的影響:ELISA結(jié)果顯示,各組細(xì)胞炎性因子IL-1β和IL-18的含量隨著染毒劑量的增加升高。與對(duì)照組相比較,20、40μg/m L劑量組IL-1β、IL-18的表達(dá)水平均升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。與10μg/m L組相比較,40μg/m L劑量組IL-1β、IL-18的表達(dá)水平均升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。4應(yīng)用抑制劑對(duì)信號(hào)通路的影響:4.1 ROS抑制劑NAC對(duì)NF-κB、NLRP3炎性小體表達(dá)水平的影響:與對(duì)照組比較,ZnO-NPs刺激可明顯提高細(xì)胞內(nèi)磷酸化p65、NLRP3與Caspase-1活性小基p10的蛋白表達(dá)水平,可使細(xì)胞培養(yǎng)上清中的IL-1β、IL-18的含量升高。NAC預(yù)處理可顯著降低ZnO-NPs誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)磷酸化p65、NLRP3、p10的蛋白高表達(dá)和IL-1β、IL-18的高表達(dá)。4.2 NF-κB抑制劑BAY11-7082對(duì)ROS、NLRP3炎性小體表達(dá)水平的影響:ZnO-NPs刺激8h后ROS表達(dá)水平(用MFI表示)為9543.44±272.81,應(yīng)用NF-κB抑制劑BAY11-7082后ROS表達(dá)水平為9042.65±314.19,兩組相比ROS水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。WB結(jié)果顯示,BAY11-7082預(yù)處理可顯著降低ZnO-NPs誘導(dǎo)的NLRP3與p10的高表達(dá)。ELISA結(jié)果顯示,ZnO-NPs刺激后細(xì)胞培養(yǎng)上清中炎性因子IL-1β、IL-18的表達(dá)水平分別為(1.60±0.09)μg/m L、(739.02±29.40)pg/m L,BAY11-7082預(yù)處理后IL-1β、IL-18的表達(dá)水平分別為(1.08±0.12)μg/m L、(331.27±70.65)pg/m L,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。4.3 NLRP3抑制劑格列本脲對(duì)炎性因子IL-1β、IL-18的影響:ZnO-NPs刺激后細(xì)胞培養(yǎng)上清中炎性因子IL-1β、IL-18表達(dá)水平分別為(1.60±0.09)μg/m L、(739.02±29.40)pg/m L;應(yīng)用NLRP3抑制劑格列本脲預(yù)處理后,IL-1β、IL-18表達(dá)水平分別為(0.96±0.10)μg/m L、(173.02±20.44)pg/m L;格列本脲預(yù)處理可顯著降低ZnO-NPs誘導(dǎo)的IL-1β、IL-18高表達(dá),差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論納米氧化鋅顆粒物可誘導(dǎo)A549細(xì)胞中NLRP3炎性小體的活化,可能是通過ROS-NF-κB-NLRP3信號(hào)通路發(fā)揮作用的。
【關(guān)鍵詞】：納米氧化鋅 NLRP3炎性小體 活性氧 核轉(zhuǎn)錄因子-κB
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：TB383.1;R364.5
【目錄】：

• 摘要4-8
• Abstract8-15
• 英文縮略詞匯表15-19
• 引言19-22
• 材料與方法22-37
• 2.1 材料22-25
• 2.1.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象與染毒物22
• 2.1.2 主要試劑22-23
• 2.1.3 主要儀器23-24
• 2.1.4 主要試劑的配制24-25
• 2.2 方法25-37
• 2.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)方法25-27
• 2.2.2 細(xì)胞染毒及分組方法27
• 2.2.3 ZnO-NPs對(duì)A549細(xì)胞的脂質(zhì)過氧化作用27-29
• 2.2.4 ZnO-NPs對(duì)A549細(xì)胞NF-κB表達(dá)水平的影響29-32
• 2.2.5 ZnO-NPs對(duì)A549細(xì)胞NLRP3炎性小體表達(dá)水平的影響32-36
• 2.2.6 應(yīng)用抑制劑對(duì)通路的影響36
• 2.2.7 數(shù)據(jù)分析處理36-37
• 結(jié)果37-51
• 3.1 ZnO-NPs對(duì)A549細(xì)胞脂質(zhì)過氧化作用的影響37-40
• 3.1.1 ZnO-NPs對(duì)A549細(xì)胞活性氧水平的影響37-38
• 3.1.2 ZnO-NPs對(duì)A549細(xì)胞丙二醛含量的影響38-39
• 3.1.3 ZnO-NPs對(duì)A549細(xì)胞超氧化物歧化酶活性的影響39-40
• 3.2 ZnO-NPs對(duì)A549細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的表達(dá)水平的影響40-41
• 3.3 ZnO-NPs對(duì)A549細(xì)胞NLRP3炎性小體活化水平的影響41-45
• 3.3.1 ZnO-NPs對(duì)A549細(xì)胞NLRP3 m RNA表達(dá)水平的影響41-43
• 3.3.2 ZnO-NPs對(duì)A549細(xì)胞NLRP3蛋白表達(dá)水平的影響43
• 3.3.3 ZnO-NPs對(duì)A549細(xì)胞炎性因子IL-1β、IL-18 表達(dá)水平的影響43-45
• 3.4 應(yīng)用抑制劑對(duì)通路的影響45-51
• 3.4.1 活性氧抑制劑NAC對(duì)NF-κB、NLRP3炎性小體表達(dá)水平的影響45-47
• 3.4.2 NF-κB抑制劑BAY11-7082 對(duì)ROS、NLRP3炎性小體的影響47-49
• 3.4.3 NLRP3抑制劑格列本脲對(duì)炎性因子IL-1β、IL-18 的影響49-51
• 討論51-55
• 4.1 ZnO-NPs對(duì)A549細(xì)胞的脂質(zhì)過氧化損傷作用51-52
• 4.2 Nano-ZnO對(duì)A549細(xì)胞NF-κB活化水平的影響52-53
• 4.3 Nano-ZnO對(duì)A549細(xì)胞NLRP3炎性小體活化水平的影響53-55
• 結(jié)論55-56
• 參考文獻(xiàn)56-59
• 綜述59-68
• 1. NLRP3炎性小體的結(jié)構(gòu)60
• 2. NLRP3炎性小體的活化60-62
• 3. NLRP3炎性小體與疾病的關(guān)系62-64
• 4. 結(jié)論64-65
• 5. 參考文獻(xiàn)65-68
• 個(gè)人簡歷、在學(xué)期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文與研究成果68-69
• 致謝69

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8 董一帆;納米氧化鋅的制備和在有機(jī)太陽能電池的應(yīng)用[D];華南理工大學(xué);2016年

9 馮曉黎;產(chǎn)前暴露于納米氧化鋅對(duì)大鼠子代腦發(fā)育及成年期行為學(xué)特性的影響[D];南方醫(yī)科大學(xué);2016年

10 陳艾婕;經(jīng)味覺通路的納米氧化鋅和納米二氧化鈦顆粒的中樞神經(jīng)毒性[D];南方醫(yī)科大學(xué);2016年

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本文編號(hào)：698031