本文關(guān)鍵詞：核殼結(jié)構(gòu)磁性納米球的制備及其在蛋白分離純化中的應(yīng)用

  更多相關(guān)文章： 磁性納米微球 核殼結(jié)構(gòu) Ni-NTA 蛋白分離純化

【摘要】：隨著基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展以及蛋白在治療學(xué)中的應(yīng)用,人們對(duì)于融合蛋白的需求日益增加。高效的蛋白分離純化手段也因而倍受青睞。磁性納米球(MNPs)由于巨大的比表面積、良好的分散性、大小可控、獨(dú)一無二的磁響應(yīng)性、易于分離等特點(diǎn),在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。與目前商業(yè)用的微米級(jí)的磁珠相比,磁性納米球分離蛋白的效率高,非特異性吸附少,但是容易聚集,穩(wěn)定性差,甚至在復(fù)雜樣本中失去磁性,嚴(yán)重限制了它們的應(yīng)用。因此,很有必要開發(fā)一種穩(wěn)定性高,分散性好、分離效率高而且能抵抗非特異性蛋白吸附的磁性納米球。本文研究?jī)?nèi)容包括兩部分:第一部分,核殼結(jié)構(gòu)磁性納米球的制備。首先,通過溶劑熱法合成了大小均一的Fe_3O_4 MNPs,平均粒徑185 nm;其次,通過Stober法對(duì)Fe_3O_4MNPs進(jìn)行包硅,提高Fe_3O_4 MNPs的化學(xué)穩(wěn)定性,所得Fe_3O_4@SiO_2 MNPs粒徑約245nm;然后,通過蒸餾沉淀聚合的方法,在Fe_3O_4@SiO_2 MNPs表面修飾聚合物PHEMA;接著,為了改善Fe_3O_4@SiO_2@PHEMA MNPs水分散性,對(duì)聚合物刷進(jìn)行衍生化,接枝丁二酸酐、EDC/NHS活化羧基、NTA酰化,最終獲得單分散親水性Fe_3O_4@SiO_2@PHEMA-SA-NTA MNPs,水化半徑為255 nm,飽和磁化值為18.58emug~(-1),金屬離子Ni~(2+)的螯合量為34.37μg/mg。第二部分,磁性納米球分離純化蛋白的應(yīng)用研究。我們利用BSA上的組氨酸基團(tuán)模擬His-tag與Fe_3O_4@SiO_2@PHEMA-SA-NTA-Ni~(2+)MNPs之間的作用,經(jīng)考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白負(fù)載量為124.87μg/mg;用正常HepG2細(xì)胞蛋白考察其抗非特異性蛋白吸附的能力,用穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系His-CAV1-HepG2細(xì)胞蛋白考察其分離純化His-tagged CAV1融合蛋白的性能,SDS-PAGE電泳和蛋白免疫印跡結(jié)果表明Fe_3O_4@SiO_2@PHEMA-SA-NTA-Ni~(2+)MNPs具備一定的抗非特異性蛋白吸附作用和特異性分離富集His-tagged蛋白的能力。
【關(guān)鍵詞】：磁性納米微球 核殼結(jié)構(gòu) Ni-NTA 蛋白分離純化
【學(xué)位授予單位】：河南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：TB383.1;TQ936
【目錄】：

• 摘要4-5
• ABSTRACT5-10
• 1 引言10-26
• 1.1 蛋白分離純化10-11
• 1.2 磁親和分離技術(shù)11-12
• 1.3 磁性納米微球的制備12-21
• 1.3.1 共沉淀法14-15
• 1.3.2 霧化蒸發(fā)法15-16
• 1.3.3 熱分解法16-18
• 1.3.4 還原法18
• 1.3.5 溶膠凝膠法18-19
• 1.3.6 水熱法/溶劑熱法19-20
• 1.3.7 微乳法20-21
• 1.4 磁性納米微球的功能化修飾21-25
• 1.4.1 生物相容性無機(jī)物21-22
• 1.4.2 配體交換22-23
• 1.4.3 包封和自組裝23-24
• 1.4.4 多功能配體24-25
• 1.5 本論文的研究意義及主要內(nèi)容25-26
• 2 核殼結(jié)構(gòu)納米球的制備及表征26-38
• 2.1 實(shí)驗(yàn)部分27-30
• 2.1.1 實(shí)驗(yàn)試劑27-28
• 2.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器28
• 2.1.3 Fe_3O_4 MNPs的合成28
• 2.1.4 Fe_3O_4 MNPs的修飾28-30
• 2.2 測(cè)試與表征30-31
• 2.2.1 透射電子顯微鏡30
• 2.2.2 粒徑分布及Zeta電位測(cè)定30
• 2.2.3 傅里葉變換紅外光譜（FTIR）測(cè)試30
• 2.2.4 熱失重分析(TGA)30-31
• 2.2.5 水分散性及磁性初步考察31
• 2.2.6 磁性強(qiáng)度檢測(cè)31
• 2.3 試驗(yàn)結(jié)果與分析31-37
• 2.3.1 TEM結(jié)果31-32
• 2.3.2 粒徑分布及Zeta電位結(jié)果32-34
• 2.3.3 FITC-IR測(cè)試結(jié)果34-35
• 2.3.4 TGA測(cè)試結(jié)果35-36
• 2.3.5 水中分散性及磁性照片36-37
• 2.3.6 磁性測(cè)試結(jié)果37
• 2.4 本章小結(jié)37-38
• 3 核殼結(jié)構(gòu)磁性納米球分離純化蛋白的應(yīng)用研究38-58
• 3.1 實(shí)驗(yàn)部分39-47
• 3.1.1 實(shí)驗(yàn)試劑39
• 3.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器39-40
• 3.1.3 MNPs上金屬離子螯合量測(cè)定40-41
• 3.1.4 MNPs蛋白洗脫條件的考察41
• 3.1.5 MNPs蛋白結(jié)合能力的考察41-43
• 3.1.6 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染43
• 3.1.7 細(xì)胞蛋白提取及定量43-44
• 3.1.8 MNPs抗非特異性吸附能力考察44-46
• 3.1.9 MNPs特異性富集分離蛋白能力考察46-47
• 3.1.10 MNPs的重復(fù)利用性考察47
• 3.2 試驗(yàn)結(jié)果與分析47-55
• 3.2.1 MNPs的金屬離子螯合量47-48
• 3.2.2 MNPs上蛋白洗脫條件48-50
• 3.2.3 MNPs的蛋白負(fù)載量50-51
• 3.2.4 細(xì)胞蛋白定量51-52
• 3.2.5 MNPs抗非特異性蛋白吸附結(jié)果52-53
• 3.2.6 MNPs特異性富集分離蛋白結(jié)果53-55
• 3.2.7 MNPs的重復(fù)利用性55
• 3.3 本章小結(jié)55-58
• 總結(jié)與展望58-60
• 參考文獻(xiàn)60-68
• 攻讀學(xué)位期間已完成工作68-70
• 致謝70-71

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