發(fā)布時(shí)間：2017-05-17 06:04

  本文關(guān)鍵詞：β-環(huán)糊精修飾的樹(shù)狀大分子包裹納米金顆粒用于基因傳遞的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：基因治療作為一種現(xiàn)代醫(yī)學(xué)和分子生物學(xué)相結(jié)合而誕生的新技術(shù),是通過(guò)將外源正�；�?qū)氚屑?xì)胞內(nèi),用以糾正或補(bǔ)償基因缺失或異常引起的疾病,從而進(jìn)行疾病治療。然而,目前基因治療最主要的障礙就是缺乏一種安全有效的傳遞表達(dá)載體。在基因載體系統(tǒng)中,主要借助病毒和非病毒載體將外源基因?qū)氚屑?xì)胞。病毒載體由于其高效的轉(zhuǎn)染效率而被應(yīng)用于臨床上的基因治療,但由于發(fā)現(xiàn)了其很多安全隱患因此進(jìn)一步的廣泛應(yīng)用受到了制約。而非病毒載體,由于其低細(xì)胞毒性、無(wú)免疫原性、易操作和高基因裝載量等特點(diǎn),越來(lái)越受到研究者們的關(guān)注。非病毒載體中,PAMAM聚酰胺胺樹(shù)狀大分子是目前研究最深入的樹(shù)狀大分子之一,它在保有樹(shù)狀大分子共性的同時(shí)又兼具自身的特性,因而受到了研究者們的廣泛關(guān)注。研究表明,PAMAM樹(shù)狀大分子的基因轉(zhuǎn)染效率和細(xì)胞毒性會(huì)隨著其代數(shù)的增加而增加。第一至四代的PAMAM毒性比較小,但基因轉(zhuǎn)染率卻很低;第五代以上的PAMAM大分子毒性較大,但基因轉(zhuǎn)染效率明顯提高。而第五代(G5)PAMAM樹(shù)狀大分子雖然有一定的毒性,但可以通過(guò)進(jìn)行表面修飾以減少表面的氨基基團(tuán)數(shù)目,從而降低表面毒性,同時(shí)又保有較好的轉(zhuǎn)染能力。因此G5 PAMAM樹(shù)狀大分子已經(jīng)作為非病毒載體應(yīng)用于基因傳遞,然而其高細(xì)胞毒性與低基因轉(zhuǎn)染效率限制了其在基因治療方面的應(yīng)用。為了提高其作為基因傳遞載體的性能,我們先將b-環(huán)糊精(β-CD)修飾到G5 PAMAM樹(shù)狀大分子表面,然后將其作為模板以1:25的樹(shù)狀大分子/金鹽摩爾比包裹金納米顆粒。在本課題的研究中,我們通過(guò)核磁共振氫譜(~1H NMR),紫外可見(jiàn)光譜(UV-vis)和透射電子顯微鏡(TEM)表征了所合成的β-CD修飾的樹(shù)狀大分子包裹納米金顆粒復(fù)合物(Au DENPs-β-CD)的物化性能;使用凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)、Zeta電勢(shì)實(shí)驗(yàn)和動(dòng)態(tài)光散射實(shí)驗(yàn)測(cè)定Au DENPs-β-CD復(fù)合物在不同N/P比下對(duì)基因的壓縮能力;材料的生物相容性則使用MTT實(shí)驗(yàn)測(cè)試。隨后則用兩種不同的報(bào)告pDNA(熒光酶Luc基因和增強(qiáng)型綠色熒光蛋白EGFP基因)以及兩種不同si RNA(B淋巴細(xì)胞瘤-2基因Bcl-2和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子VEGF)分別在293T細(xì)胞和惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87MG細(xì)胞內(nèi)驗(yàn)證材料作為載體應(yīng)用在傳遞基因方面的能力。結(jié)果顯示Au DENPs-β-CD可以在低N/P時(shí)完全包裹pDNA(N/P=0.5時(shí))及siRNA(N/P=2時(shí)),與未修飾β-CD的Au DENPs相比顯現(xiàn)出較低的細(xì)胞毒性與高效的基因傳遞效率。因其優(yōu)越的基因壓縮能力、低細(xì)胞毒性及高基因轉(zhuǎn)染效率,我們期待Au DENPs-β-CD能成為一種新的安全有效的非病毒載體應(yīng)用于基因治療。
【關(guān)鍵詞】：聚酰胺胺樹(shù)狀大分子 β-環(huán)糊精 納米金顆粒 基因傳遞
【學(xué)位授予單位】：東華大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R440;TB383.1
【目錄】：

• 摘要5-7
• ABSTRACT7-12
• 第一章 緒論12-23
• 1.1 基因治療（Gene Therapy）12-14
• 1.1.1 基因治療簡(jiǎn)介12
• 1.1.2 基因治療常用方法12-13
• 1.1.3 基因治療載體系統(tǒng)13-14
• 1.2 RNA干擾（RNA Interfering）14-16
• 1.2.1 RNA干擾簡(jiǎn)介14-15
• 1.2.2 RNA干擾的研究歷史15
• 1.2.3 RNA干擾的主要研究方向15-16
• 1.2.4 RNA干擾所亟需解決的問(wèn)題16
• 1.3 陽(yáng)離子聚合物載體PAMAM16-19
• 1.3.1 樹(shù)狀大分子簡(jiǎn)介16-17
• 1.3.2 PAMAM簡(jiǎn)介17-18
• 1.3.3 PAMAM基因治療方面應(yīng)用18
• 1.3.4 PAMAM在siRNA基因方面的應(yīng)用18-19
• 1.4 β-環(huán)糊精（β-CD）19
• 1.4.1 環(huán)糊精（CDs）簡(jiǎn)介19
• 1.4.2 β-環(huán)糊精（β-CD）基因治療方面的應(yīng)用19
• 1.5 樹(shù)狀大分子包裹的納米金顆粒（Au DENPs）19-21
• 1.5.1 納米金屬顆粒簡(jiǎn)介19-20
• 1.5.2 樹(shù)狀大分子包裹的金屬納米顆粒20
• 1.5.3 樹(shù)狀大分子包裹的納米金顆�；蛑委煼矫娴膽�(yīng)用20-21
• 1.6 本論文研究的內(nèi)容及創(chuàng)新點(diǎn)21-23
• 1.6.1 研究?jī)?nèi)容21-22
• 1.6.2 課題創(chuàng)新點(diǎn)22-23
• 第二章 β-CD修飾樹(shù)狀大分子包裹納米金顆粒Au DENPs-β-CD的合成與表征23-29
• 2.1 引言23
• 2.2 實(shí)驗(yàn)材料與設(shè)備23-24
• 2.2.1 藥品和試劑23-24
• 2.2.2 主要儀器24
• 2.3 實(shí)驗(yàn)方法24-25
• 2.3.1 G5.NH_2-β-CD的合成24
• 2.3.2 Au DENPs-β-CD的合成24
• 2.3.3 G5.NH_2-β-CD的表征24-25
• 2.3.4 Au DENPs-β-CD的表征25
• 2.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論25-28
• 2.4.1 ~1H NMR核磁氫譜26
• 2.4.2 紫外可見(jiàn)光譜26-27
• 2.4.3 末端氨基定氮27-28
• 2.4.4 透射電子顯微鏡（TEM）28
• 2.5 小結(jié)28-29
• 第三章 Au DENPs-β-CD載體/基因復(fù)合物的制備與表征29-40
• 3.1 引言29-30
• 3.2 實(shí)驗(yàn)材料與設(shè)備30-31
• 3.2.1 藥品和試劑30
• 3.2.2 主要儀器30-31
• 3.3 實(shí)驗(yàn)方法31-34
• 3.3.1 質(zhì)粒的提取31-32
• 3.3.2 質(zhì)粒的定量32
• 3.3.3 質(zhì)粒的標(biāo)記32-33
• 3.3.4 各載體/pDNA復(fù)合物的制備與表征33
• 3.3.5 各載體/siRNA復(fù)合物的制備與表征33-34
• 3.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)論34-39
• 3.4.1 質(zhì)粒的提取34
• 3.4.2 各載體/pDNA復(fù)合物的制備與表征34-36
• 3.4.3 各載體/siRNA復(fù)合物的制備與表征36-39
• 3.5 小結(jié)39-40
• 第四章 Au DENPs-β-CD載體/基因復(fù)合物轉(zhuǎn)染效率實(shí)驗(yàn)40-58
• 4.1 引言40
• 4.2 實(shí)驗(yàn)材料與設(shè)備40-42
• 4.2.1 藥品和試劑40-41
• 4.2.2 主要儀器41-42
• 4.3 實(shí)驗(yàn)方法42-48
• 4.3.1 各載體/pDNA復(fù)合物轉(zhuǎn)染效率實(shí)驗(yàn)42-43
• 4.3.2 各載體/siRNA復(fù)合物轉(zhuǎn)染效率實(shí)驗(yàn)43-48
• 4.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)論48-57
• 4.4.1 各載體/pDNA復(fù)合物轉(zhuǎn)染效率實(shí)驗(yàn)48-53
• 4.4.2 各載體/siRNA復(fù)合物轉(zhuǎn)染效率實(shí)驗(yàn)53-57
• 4.5 小結(jié)57-58
• 第五章 結(jié)論與展望58-59
• 參考文獻(xiàn)59-65
• 攻讀碩士期間發(fā)表論文65-66
• 致謝66

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