背景蛋白質(zhì)和核酸檢測對于病原感染、遺傳疾病、法醫(yī)分析和現(xiàn)代生命科學(xué)的發(fā)展至關(guān)重要。但是,生物分析往往目標(biāo)物含量少、雜質(zhì)多,因而開發(fā)新型的高靈敏檢測手段十分必要。納米材料具有獨(dú)特的光學(xué)性質(zhì)和良好的生物相容性因而廣泛應(yīng)用于生物分析中。核酸酶是能夠?qū)⒑怂徭湹牧姿岫ユI切斷的酶,常作為一種重要的工具用于生物分析中。本研究通過新型的納米材料核酸酶的DNA末端保護(hù)技術(shù)和信號放大技術(shù)構(gòu)建了背景低、特異性好、靈敏度高的核酸與蛋白質(zhì)檢測的新方法。目的（1）構(gòu)建基于陽離子共軛聚合物和外切酶Ⅰ的熒光檢測方法用于蛋白質(zhì)檢測及細(xì)胞成像,實(shí)現(xiàn)鏈霉親和素和葉酸受體的檢測以及HeLa熒光成像;（2）構(gòu)建基于核酸外切酶Ⅲ及MoS₂納米片熒光猝滅性能的DNA雙重信號放大檢測方法,實(shí)現(xiàn)人血色素沉著癥基因的檢測。方法（1）鏈霉親和素（Strepavidin,SA）和生物素可以通過特異性結(jié)合,從而阻止探針核酸P1被核酸外切酶Ⅰ（Exonuclease Ⅰ,Exo Ⅰ）的消化,帶正電荷的陽離子熒光共軛聚合物（Polymer poly（9,9-bis（6’-N,N,Ntrimethylammonium）hex... 

【文章來源】：新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院河南省

【文章頁數(shù)】：53 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

制備的PFP的FTIR光譜（A）和Zeta電位（B）

新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院碩士學(xué)位論文9以具有較高熒光量子產(chǎn)率的PFP（Ex:370nm,Em:425nm）為能量供體。選擇最大吸收在490nm處，發(fā)射在530nm處的FAM標(biāo)記P1為受體，因?yàn)槠湮张cPFP的特征發(fā)射重疊（425nm，圖1.3）。在沒有SA的情況下，P1被ExoI從3’端依次消化水解成單核苷酸。而由于單核苷酸與PFP之間的靜電相互作用相對較弱，導(dǎo)致FAM遠(yuǎn)離PFP，F(xiàn)RET很難發(fā)生。當(dāng)SA存在時(shí)，SA和生物素的高度結(jié)合阻止了P1被ExoI消化，這是由于蛋白質(zhì)-配體特異性相互作用產(chǎn)生了顯著的空間位阻。隨后，帶正電荷的PFP通過靜電相互作用靠近P1，使得從PFP到FAM發(fā)生FRET，在530nm處檢測到增強(qiáng)的熒光發(fā)射。因此，通過檢測FAM和PFP的FRET比值（I530/I425）來實(shí)現(xiàn)目標(biāo)檢測。FRET比值與SA的濃度成正比。圖1.1制備的PFP的FTIR光譜（A）和Zeta電位（B）。Fig.1.1FTIRspectrum(A)andzetapotential(B)oftheas-preparedPFP.圖1.2基于陽離子共軛聚合物和外切酶I的蛋白質(zhì)檢測原理圖。Fig.1.2SchematicdiagramofproteindetectionbasedoncationicconjugatedpolymerandExoI.

新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院碩士學(xué)位論文10圖1.3PFP(abs,a;em,b)和P1(abs,c;em,d)的吸光度和熒光光譜。Fig.1.3AbsorbanceandfluorescencespectraofPFP(Abs,a;Em,b)andP1(Abs,c;Em,d).1.3.2方法的可行性分析首先通過凝膠電泳驗(yàn)證SA對P1的末端保護(hù)。如圖1.4A所示，只有P1時(shí)有一個(gè)非常明顯的條帶（泳道1），在加入ExoI后（泳道2）條帶消失。這表明ExoI能夠有效地消化水解P1。在沒有ExoI的情況下，將P1與SA混合，觀察到兩個(gè)條帶發(fā)生不同的條帶遷移（泳道3），這歸因于P1和SA的結(jié)合。當(dāng)P1與SA結(jié)合后加入ExoI時(shí)，仍然檢測到條帶遷移（泳道4）。這證明SA-P1復(fù)合物能保護(hù)P1使其免受ExoI消化。測量了不同條件下FRET的熒光強(qiáng)度，驗(yàn)證了該方法的可行性。相應(yīng)的熒光光譜如圖1.4B所示。在發(fā)射波長530nm、激發(fā)波長370nm處，P1表現(xiàn)出很弱的熒光強(qiáng)度（曲線a）。在P1溶液中加入PFP，在425nm處和530nm處可以明顯觀察到PFP和FAM的熒光信號（曲線b）。結(jié)果證實(shí)，P1通過強(qiáng)靜電力與PFP結(jié)合，并導(dǎo)致從PFP到FAM發(fā)生有效的FRET。然而，在加入PFP之前隨著ExoI和P1的混合，在沒有SA的情況下，530nm處的熒光強(qiáng)度顯著降低（曲線c）。這一現(xiàn)象表明ExoI催化消化P1產(chǎn)生單核苷酸，導(dǎo)致PFP和FAM之間的FRET效率低下。而P1與SA混合，然后加入ExoI和PFP，結(jié)果PFP在425nm處的熒光強(qiáng)度降低，530nm處熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)（曲線d）。表明生物素與SA的特異性結(jié)合抑制ExoI消化P1并產(chǎn)生有效的FRET。上述結(jié)果表明，該方法可用于蛋白質(zhì)分析。


本文編號：3535103