絲膠（Silk sericin,SS）是桑蠶絲中包裹絲素組分的外層蛋白,屬于桑蠶絲脫膠加工的副產(chǎn)物,具有較高的反應(yīng)活性、良好的低免疫原性和生物相容性。另一方面,由于絲膠水溶性較高,以其為原料加工的再生蛋白膜材料的成型穩(wěn)定性不理想,表現(xiàn)為水相條件下溶失率較高,不同程度上限制了其在生物材料領(lǐng)域的應(yīng)用。本文采用谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶（TGase）催化酰胺基轉(zhuǎn)移反應(yīng),實(shí)現(xiàn)絲膠大分子間交聯(lián),旨在通過(guò)提升絲膠蛋白的分子量,改善絲膠基材料的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性;在此基礎(chǔ)上,分別選取殼寡糖（Chitosan oligosaccharides,COS）和殼聚糖（Chitosan,CS）,考察TGase催化氨基多糖與絲膠蛋白的接枝和橋接交聯(lián)效果,在降低絲膠蛋白材料水溶性的同時(shí),賦予絲膠基再生材料一定的功能性,制備抗菌和抗氧化絲膠基復(fù)合膜材料。首先選用含谷氨酰胺（Q）和賴氨酸（K）的定制肽（GQGEGQG,p-Q;KKKK,p-K）,探究多肽對(duì)TGase催化絲膠分子間發(fā)生酰基轉(zhuǎn)移反應(yīng)的影響;借助SDS-PAGE、SEC色譜評(píng)價(jià)蛋白體系分子量變化;結(jié)合酶促反應(yīng)體系釋氨量、游離氨基含量測(cè)定,評(píng)價(jià)TGase酶催化絲膠交聯(lián)效果。結(jié)果... 

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【學(xué)位級(jí)別】：碩士

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TGase催化蛋白分子間發(fā)生轉(zhuǎn)酰胺反應(yīng)的途徑Fig.1-1.TheproposedreactionpathwayofTGase-catalyzedacyltransferreactionsbetweenprotein

江南大學(xué)碩士學(xué)位論文102.4測(cè)試方法2.4.1絲膠蛋白溶液濃度的測(cè)定把三個(gè)具有一定規(guī)格稱量瓶，放入105℃烘箱中烘干致重量不在變化，質(zhì)量分別記錄為w1、w2、w3。然后，往稱量瓶?jī)?nèi)分別滴加VmL絲膠蛋白溶液，再次置于烘箱烘干，質(zhì)量記錄為w1"、w2"、w3"。絲膠蛋白溶液的濃度c采用公式（2-1）計(jì)算，三次測(cè)試結(jié)果取平均值[60]。c=w-w′V×100%(2-1)2.4.2釋放氨含量的測(cè)定采用靛酚藍(lán)法檢測(cè)TGase處理過(guò)程中釋氨量[61]。以氨質(zhì)量濃度為1~7μg/mL硫酸銨溶液作為標(biāo)準(zhǔn)液，濃度C為橫坐標(biāo)，637nm處吸光度Ai為縱坐標(biāo)，繪制釋氨量標(biāo)準(zhǔn)曲線：Ai=0.096C+0.022，R2=0.99907。圖2-1不同濃度的硫酸銨溶液中氨態(tài)氮濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2-1Standardcurveofammonianitrogenconcentrationindifferentconcentrationsofammoniumsulfatesolution2.4.3氨基含量分析通過(guò)使用茚三酮法測(cè)定溶液中氨基量的變化，該方法基于甘基酸可與茚三酮反應(yīng)形成藍(lán)紫色物質(zhì)[62,63]。顏色深度與溶液中氨基的量成一定比例，測(cè)定其在568nm處的吸光度相對(duì)于氨基濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線：Y=0.2506X+0.0171，R2=0.99647，其中Y為568nm溶液吸光度，X為甘氨酸濃度（10-5g/mL）。

第二章實(shí)驗(yàn)材料、儀器和方法11圖2-2甘氨酸中游離氨基濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2-2Standardcurveofthecontentofprimaryaminesinglycine2.4.4SDS-PAGE凝膠電泳采用SDS-PAGE分析TGase處理前后絲膠的分子量變化情況[64]。測(cè)試：首先將樣品溶液與上樣緩沖液（4×Laemmli:2-巰基乙醇=9:1）按體積比為3:1的比例混合后，煮沸10分鐘。將電泳膠安裝于蛋白質(zhì)凝膠電泳儀中，取將適量樣品上樣到8%~16%電泳膠孔內(nèi)，在150V下對(duì)樣品進(jìn)行分離。電泳完成后，取出凝膠于Bio-SafeTMCoomassieG-250Stain中浸染1h，隨后將其放在去離子水中進(jìn)行脫色30min。測(cè)試中使用10~170kDa的SDS-PAGE蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)物作為分子量標(biāo)記物。2.4.5體積排阻色譜（SEC）WatersE2695高效液相色譜儀可用來(lái)測(cè)試不同條件下反應(yīng)后絲膠溶液的分子量變化。絲膠溶液經(jīng)0.22μm的濾膜過(guò)濾后置于液相瓶中等待測(cè)試，測(cè)試條件為：進(jìn)樣量為10μL，流速0.5mL/min，柱溫25℃。采用0.3mol/L氯化鈉和50mmol/L磷酸鹽緩沖溶液（pH=7.0）作為流動(dòng)相，使用Ultrahydrogellinear色譜柱（Waters，USA），2998PDADetector紫外檢測(cè)器檢測(cè)樣品溶液在214nm處的SEC曲線。2.4.6傅里葉變換紅外光譜（FTIR）通過(guò)NicoletIS10紅外光譜儀（ThermoNicolet，USA）檢測(cè)不同絲膠凍干膜的結(jié)構(gòu)變化。采用溴化鉀壓片法，將樣品凍干膜與溴化鉀混合均勻，進(jìn)行研磨壓片，然后掃描32次，收集2000至500cm-1范圍內(nèi)的相應(yīng)光譜，分辨率為4cm-1。采用OmnicV6.2和origin軟件經(jīng)去卷積和曲線擬合等數(shù)學(xué)方法進(jìn)一步處理后，得到各樣品二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化[65]。

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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碩士論文
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[3]基于酶促改性的抗氧化絲素膜的制備[D]. 齊成龍.江南大學(xué) 2015
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本文編號(hào)：3444116