固態(tài)納米孔作為傳感元件已被廣泛應(yīng)用于蛋白和核酸分析。然而,極低的捕獲效率及較快的穿孔速率限制了固體納米孔傳感器的靈敏度和分辨率。本研究制備了一種聚苯胺導(dǎo)電聚合物修飾的固態(tài)納米孔,探究了ssDNA和dsDNA在其中的穿孔行為。研究表明,聚苯胺涂層與DNA間的靜電相互作用能顯著地將ssDNA的穿孔速率降低至48.2μs/base;同時(shí),通過采用LiCl作為電解質(zhì)溶液,此聚苯胺納米孔對ssDNA的捕獲效率明顯增加。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),基于阻塞電流幅度和穿孔時(shí)間的不同,聚苯胺納米孔能夠?qū)崿F(xiàn)ssDNA與dsDNA的區(qū)分。研究結(jié)果表明,固態(tài)納米孔的功能修飾能夠有效調(diào)控DNA分子穿孔行為。制備的聚苯胺納米孔有望作為一個(gè)單分子納米器件應(yīng)用于生物分子的分析和檢測。 

【文章來源】：分析化學(xué). 2020,48(03)北大核心EISCICSCD

【文章頁數(shù)】：7 頁

【部分圖文】：

(A)聚苯胺(PANI)納米孔檢測DNA穿孔過程的示意圖,灰色部分為基底-單離子徑跡聚碳酸酯膜(PC膜),綠色表示PANI涂層; (B)PANI的化學(xué)結(jié)構(gòu); (C)PC納米孔刻蝕過程的電流-時(shí)間變化,插圖為刻蝕電流為0～0.5 nA時(shí)的電流-時(shí)間曲線; (D)PC納米孔修飾PANI前后,通道I-V曲線的對比,插圖為放大后的PANI納米孔的通道I-V曲線。實(shí)驗(yàn)條件: 1 mol/L KCl, 10 mmol/L Tris-HCl,pH= 7.0

采用未修飾且具有相似孔徑大小的PC膜納米孔開展了ssDNA穿孔實(shí)驗(yàn),研究表明,在0.1 mol/L KCl溶液中, +900 mV 電壓作用下, 未檢測到ssDNA的穿孔信號(圖2A)。這可能是由于ssDNA穿孔速率太快,超出了單通道儀器檢測的分辨率。然而,將ssDNA加入到聚苯胺納米孔的檢測池中,可以看到明顯的電流阻塞信號。修飾聚苯胺后的納米孔基線波動(dòng)較大,這可能是由于孔內(nèi)壁聚苯胺涂層不均勻引起。對照實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,在ssDNA不存在時(shí),或施加-900 mV電壓,無電流阻塞信號產(chǎn)生,證明此信號確實(shí)是由ssDNA與聚苯胺納米孔相互作用產(chǎn)生。圖2B為ssDNA穿孔滯留時(shí)間柱狀圖,通過單指數(shù)擬合發(fā)現(xiàn),其值為τoff=(1.14 ± 0.05) ms,因此ssDNA的平均穿孔速率約為48.2 μs/base。同其它納米孔相比(DNA穿孔速率約1～20 μs/base)[17,25～28],DNA在聚苯胺納米孔的穿孔速率減小2.4～48倍。這是由于帶正電荷的聚苯胺與帶負(fù)電荷的DNA存在著靜電相互作用,延緩了DNA的穿孔時(shí)間。圖2C為ssDNA阻塞電流的柱狀圖,符合高斯分布,其統(tǒng)計(jì)值ΔI= (7.01 ± 0.14) pA。為了驗(yàn)證聚苯胺對ssDNA存在著靜電相互作用,進(jìn)行了聚苯胺納米孔對ssDNA的靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)。向緩沖液加入ssDNA(終濃度0.5 μmol/L),經(jīng)10 h靜態(tài)吸附后,對PANI納米孔進(jìn)行電化學(xué)I-V表征。如圖2D所示,相比于未進(jìn)行吸附實(shí)驗(yàn)的聚苯胺納米孔,吸附DNA后的聚苯胺納米孔在正電壓下的電流值變小,而在負(fù)電壓下電流值變大,并且吸附DNA后,PANI納米孔幾乎不具有整流效應(yīng)。這是由于PANI納米孔對DNA的靜電吸附作用使得內(nèi)部的電荷分布發(fā)生了變化,孔壁中原本帶正電荷的PANI被吸附的DNA覆蓋后,表面的電荷發(fā)生中和,導(dǎo)致孔壁的凈電荷密度減小,因此納米通道無明顯的整流效應(yīng)。通過研究不同電壓下ssDNA的穿孔行為發(fā)現(xiàn),穿孔時(shí)間隨著電壓的增加而逐漸減少,據(jù)此可推斷ssDNA穿過了聚苯胺納米孔(圖2E)。電壓依賴性實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),ssDNA的穿孔頻率隨電壓的增加而接近線性增大,表明擴(kuò)散控制的捕獲過程起主導(dǎo)作用(圖2F)。進(jìn)一步的研究表明,在0.1 mol/L KCl溶液中,當(dāng)施加電壓V<700 mV, 幾乎檢測不到DNA的穿孔信號,這可能是因?yàn)閟sDNA受到的電場力不足以克服聚苯胺對其的靜電吸引力,難以使DNA從管壁內(nèi)部脫附下來,并穿過納米通道。另外一個(gè)可能的因素是由于低電壓產(chǎn)生的電滲流較小,未能驅(qū)動(dòng)ssDNA進(jìn)入聚苯胺納米孔,因而也未產(chǎn)生阻塞電流。在納米孔DNA分析中,多采用KCl或NaCl作為電解質(zhì)溶液,但其穿孔速率過快或穿孔幾率過低的缺點(diǎn)影響了納米孔單分子分析的靈敏度和分辨率。Kowalczyk等[25]研究發(fā)現(xiàn),采用Li+作為ssDNA的抗衡離子,能夠有效減小其所帶電荷,增加其穿孔時(shí)間,分辨率至少提高10倍。最近,Hu等[29]研究表明,Li+可減少蛋白納米孔對長鏈ssDNA的捕獲能壘,使其穿孔幾率增強(qiáng)了10.23倍。

在0.1 mol/L LiCl溶液中,向檢測池cis端加入50 nmol/L ssDNA并施加+900 mV的電壓后,單通道電流trace及特征阻塞信號如圖3A所示。研究表明,相比于0.1 mol/L KCl溶液(τoff=(1.14 ± 0.05) ms),ssDNA在0.1 mol/L LiCl溶液中阻塞電流信號的平均滯留時(shí)間統(tǒng)計(jì)值(τoff=(1.55 ± 0.14) ms)是其的1.36倍(圖3B)。當(dāng)Li+濃度增加到1 mol/L和3 mol/L時(shí),ssDNA穿孔時(shí)間分別增加了2.35倍和8.91倍,其統(tǒng)計(jì)值分別為(3.64 ± 0.16) ms和(13.82 ± 0.76) ms。這是因?yàn)橄啾扔贙+,Li+與ssDNA具有更強(qiáng)的鍵合作用[27],能有效降低ssDNA鏈上所帶的負(fù)電荷,因此,在相同電壓下,ssDNA在Li+溶液中受到較小的電泳力作用,導(dǎo)致其穿孔速率減慢。而且隨著Li+濃度增加,ssDNA的表面會(huì)結(jié)合更多的電荷抗衡離子,導(dǎo)致受到的電場驅(qū)動(dòng)力更小,因而穿孔時(shí)間更長。雖然DNA表面負(fù)電荷的減少使其受到聚苯胺靜電作用減小,導(dǎo)致穿孔速率增加,但電場力的主導(dǎo)作用使得ssDNA的滯留時(shí)間延長。研究還發(fā)現(xiàn),高濃度Li+能產(chǎn)生更大的ssDNA電流阻塞幅度。ssDNA在不同濃度LiCl中穿孔頻率如圖3D所示,在0.1 mol/L LiCl(+900 mV)中,ssDNA的穿孔頻率為(83.25 ±2.69) s-1,是同濃度KCl溶液中的1.30倍((64.07± 0.05) s-1)。在納米孔單分子分析中,電滲流(EOF)的大小影響分析物的穿孔頻率,當(dāng)EOF和EP的方向相同時(shí),EOF越大,穿孔頻率越大。而EOF的強(qiáng)度依賴于施加在納米孔兩端的電壓、電解質(zhì)的濃度、電解質(zhì)的類型等因素。以往的研究表明,EOF在LiCl中的強(qiáng)度比在KCl中大[27,30]。因此,在本研究中,施加相同電壓(+900 mV)時(shí),ssDNA在0.1 mol/L LiCl中穿孔幾率比在同濃度KCl中大。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn),隨著Li+濃度增加,ssDNA的穿孔頻率降低,這與文獻(xiàn)[30]一致[30]。這可能是由于隨著鹽濃度增加,聚苯胺納米孔內(nèi)壁的正電荷受到的屏蔽效應(yīng)增大,導(dǎo)致孔的離子選擇性降低,進(jìn)而使EOF降低�？傊�,采用LiCl作為電解質(zhì)溶液可明顯增加聚苯胺納米孔對ssDNA的捕獲率,同時(shí)增加ssDNA的穿孔時(shí)間。3.3 PANI納米孔對dsDNA穿孔行為的研究


本文編號：3124031