第一章硼酸功能化納米顆粒的制備及性能評價目的:糖蛋白在許多生物過程中都起著重要作用,并且可以用作許多疾病的生物標(biāo)志物。對糖蛋白進(jìn)行有效分離在糖蛋白結(jié)構(gòu)和功能研究中必不可少,因此制備高性能的糖蛋白分離、富集材料具有重要意義。利用硼酸可以與糖蛋白糖基上順式二醇結(jié)合成酯的選擇性結(jié)合特性,本研究在SiO_2納米顆粒表面制備了兩種不同硼酸分布形式的聚合物刷,通過對比分析研究硼酸功能化納米顆粒吸附糖蛋白性能的結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系。方法:在SiO_2納米顆粒表面修飾引發(fā)劑,然后以甲基丙烯酸縮水甘油酯(GMA)為單體,通過表面引發(fā)的原子轉(zhuǎn)移自由基聚合(SI-ATRP)法,在SiO_2納米顆粒表面制備了聚合物刷SiO_2@PGMA,并通過以下兩種不同方法在其表面修飾疊氮基團:(1)酸化開環(huán)后加疊氮:用硫酸處理SiO_2@PGMA,將GMA支鏈環(huán)氧基開環(huán)羥化后,再用疊氮化鈉對分子鏈主鏈末端Br活性位點進(jìn)行修飾,得到僅在分子鏈主鏈末端帶有疊氮基的SiO_2@PGMA-OH@N_3。(2)直接開環(huán)加疊氮:利用疊氮化鈉與GMA上環(huán)氧基及主鏈末端Br活性位點反應(yīng),得到在分子鏈主鏈末端和支鏈均帶有疊氮基的SiO_2@PGMA-N_3@N_3。最后通過疊氮-炔基的點擊化學(xué)反應(yīng)將炔基苯硼酸分別結(jié)合到兩種帶有疊氮基的納米顆粒表面,分別得到僅在聚合物刷主鏈末端帶有硼酸的SiO_2@PGMA-OH@BA,和在聚合物刷支鏈及主鏈末端均帶有硼酸基團的SiO_2@PGMA-BA@BA。利用電鏡、紅外光譜、熱重分析、元素分析的方法,分析兩種顆粒的物理化學(xué)特征;使用茜素紅S熒光發(fā)光法評價顆粒表面硼酸功能化水平;通過紫外分光光度法測定納米顆粒在溶液中的分散性,靜態(tài)吸附實驗分析不同顆粒對糖蛋白的吸附量。最終分析不同納米顆粒的硼酸化水平和溶液分散性對其糖蛋白吸附性能的影響。結(jié)果:紅外光譜、熱重分析、元素分析顯示在SiO_2納米顆粒表面成功修飾了兩種帶硼酸功能團的聚合物刷,其中在聚合物刷支鏈及主鏈末端均帶有硼酸基團的SiO_2@PGMA-BA@BA的硼酸化水平高于僅在聚合物刷主鏈末端帶有硼酸基團的SiO_2@PGMA-OH@BA,但是SiO_2@PGMA-OH@BA在水溶液中分散性更好。蛋白吸附實驗顯示,兩種硼酸功能化納米顆粒對糖蛋白的吸附平衡時間約為2小時。兩種納米顆粒對糖蛋白(卵清蛋白和辣根過氧化物酶)的吸附能力都顯著高于非糖蛋白(牛血清白蛋白);且對糖基化水平更高的卵清蛋白的吸附量均明顯高于糖基化水平較低的辣根過氧化物酶。兩種顆粒對糖蛋白的吸附量均具有pH響應(yīng)性,吸附量隨pH的變化規(guī)律為pH 9.0pH 7.4pH 4.0。在聚合物刷支鏈及主鏈末端均帶有硼酸基團的SiO_2@PGMA-BA@BA對卵清蛋白的最大吸附容量Q_(max)=153.40 mg/g,而僅在聚合物刷主鏈末端帶有苯硼酸基團的SiO_2@PGMA-OH@BA對卵清蛋白的Q_(max)=126.70 mg/g,兩者的Q_(max)無統(tǒng)計學(xué)差異。結(jié)論:本方法成功在SiO_2納米顆粒表面修飾了兩種硼酸化程度不同的聚合物刷,所得到的兩種硼酸化程度不同的納米顆粒均可特異性吸附糖蛋白,且對糖蛋白的吸附均有pH響應(yīng)性。聚合物刷支鏈與主鏈末端均修飾硼酸的SiO_2@PGMA-BA@BA的硼酸化水平高于僅在主鏈末端修飾硼酸的SiO_2@PGMA-OH@BA,但前者在水溶液中的分散性較差,兩者對卵清蛋白的最大吸附容量Q_(max)無顯著差異,顯示在吸附糖蛋白過程中發(fā)揮主要作用的是位于聚合物刷主鏈末端的硼酸功能團。第二章溫度響應(yīng)性硼酸功能化納米顆粒的制備及性能評價目的:環(huán)境響應(yīng)性納米材料在生物分離、生物傳感、基因傳遞、藥物緩釋等方面具有很好的應(yīng)用前景。本章研究在第一章制備的硼酸功能化納米顆�；A(chǔ)上,引入溫度響應(yīng)性功能單體N-異丙基丙烯酰胺(NIPAm),制備溫度響應(yīng)性的硼酸功能化納米顆粒,進(jìn)一步分析硼酸功能團分布特征、納米顆粒水溶性、溫度等因素對納米顆粒吸附糖蛋白性能的影響。方法:使用第一章制備的表面含有引發(fā)劑的SiO_2納米顆粒,在其引發(fā)聚合過程中,以NIPAm和甲基丙烯酸縮水甘油酯(GMA)共同作為功能單體,通過表面引發(fā)的原子轉(zhuǎn)移自由基聚合(SI-ATRP)法,在SiO_2納米顆粒表面制備含有兩種功能單體的NIPAm-co-GMA共聚物刷SiO_2@PNCG。然后通過以下兩種方法對SiO_2@PNCG進(jìn)行疊氮功能化:(1)硫酸酸化后再疊氮化,得到SiO_2@PNCG-OH@N_3;(2)直接疊氮功能化,得到SiO_2@PNCG-N_3@N_3。另外僅用NIPAm作為功能單體,SI-ATRP法合成聚合物刷SiO_2@PNIPAm,將SiO_2@PNIPAm分子鏈末端活性基團修飾疊氮功能團得到SiO_2@PNIPAm@N_3。最后通過疊氮-炔基的點擊化學(xué)反應(yīng)將炔基苯硼酸分別結(jié)合到三種帶有疊氮的納米顆粒表面,得到僅在共聚物刷主鏈末端帶有硼酸基團的SiO_2@PNCG-OH@BA,在共聚物刷支鏈及主鏈末端均帶有硼酸基團的SiO_2@PNCG-BA@BA,以及僅在聚NIPAm刷主鏈末端帶有硼酸基團的SiO_2@PNIPAm@BA。利用電鏡、紅外光譜、熱重分析、元素分析的方法,分析三種顆粒的物理化學(xué)特征;使用茜素紅S熒光發(fā)光法評價顆粒表面的硼酸功能化水平;紫外分光光度法分別測定納米顆粒在水溶液中的分散性;靜態(tài)吸附實驗分析不同顆粒對不同糖蛋白的吸附量,以及不同溫度、pH條件下各種納米顆粒的蛋白吸附性能。將溫度敏感性納米顆粒的性能與第一章所制備的非溫度敏感性納米顆粒性能進(jìn)行對比,綜合評價硼酸化水平、納米顆粒在水溶液中的分散性等因素對不同納米顆粒吸附蛋白性能的影響。結(jié)果:紅外光譜、熱重分析、元素分析顯示在SiO_2納米顆粒表面成功修飾了系列帶硼酸功能團的溫度響應(yīng)性聚合物刷。其中NIPAm-co-GMA共聚物刷支鏈及主鏈末端均帶有硼酸基團的SiO_2@PNCG-BA@BA的硼酸功能化水平最高,共聚物刷僅主鏈末端帶有硼酸基團的SiO_2@PNCG-OH@BA次之,僅聚NIPAm刷主鏈末端帶有硼酸基團的SiO_2@PNIPAm@BA最低。這三種溫度響應(yīng)性硼酸功能化納米顆粒在水溶液中的分散性沒有明顯差異,均好于第一章中不含NIPAm的納米顆粒,且在水溶液中的分散度具有溫度響應(yīng)性,在40℃時的分散性低于20℃時的分散性。三種納米顆粒對糖蛋白(卵清蛋白和辣根過氧化物酶)的吸附量顯著大于非糖蛋白(牛血清白蛋白)。且對糖基化水平更高的卵清蛋白的吸附量均明顯高于糖基化水平較低的辣根過氧化物酶。三種顆粒對糖蛋白的吸附量都具有pH響應(yīng)性和溫度響應(yīng)性,吸附量隨pH的變化規(guī)律為pH 9.0pH 7.4pH 4.0,40℃時的吸附量顯著低于20℃時的吸附量。在共聚物刷僅主鏈末端帶有硼酸基團的SiO_2@PNCG-OH@BA對卵清蛋白的最大吸附容量Q_(max)=129.64 mg/g,共聚物刷支鏈及主鏈末端均帶有硼酸基團的SiO_2@PNCG-BA@BA的Q_(max)=159.38 mg/g,聚NIPAm刷僅主鏈末端帶有硼酸基團的SiO_2@PNIPAm@BA的Q_(max)=118.37 mg/g,三者之間沒有統(tǒng)計學(xué)差異。結(jié)論:本方法所制備的三種溫度響應(yīng)性硼酸功能化聚合物刷修飾的SiO_2納米顆粒,均可以特異性吸附糖蛋白,且對糖蛋白的吸附具有pH和溫度響應(yīng)性。三種納米顆粒的硼酸化水平不同,但對卵清蛋白的最大吸附容量Q_(max)沒有顯著差異,說明在吸附糖蛋白過程中發(fā)揮主要作用的是位于聚合物刷主鏈末端的硼酸功能團。三種溫度響應(yīng)性硼酸功能化納米顆粒在水溶液中的分散性均高于第一章非溫度響應(yīng)性的硼酸功能化納米顆粒,但是5種納米顆粒對糖蛋白的吸附量并無顯著差異,說明硼酸功能化納米顆粒在水溶液中的分散性不是影響其結(jié)合糖蛋白的主要因素。本研究有助于深入了解聚合物刷上特定功能團的位置和數(shù)量對特定功能的影響。第三章溫度響應(yīng)性硼酸功能化納米顆粒用于糖蛋白分離目的:本章利用溫度響應(yīng)性硼酸功能化納米顆粒開發(fā)用于復(fù)雜樣品中糖蛋白的分離的新方法,探討最低程度改變蛋白質(zhì)溶液化學(xué)組成、最高程度分離純化蛋白質(zhì)的條件。將優(yōu)化的條件應(yīng)用于復(fù)雜樣品中的糖蛋白分離,提高硼酸功能化納米顆粒對糖蛋白的分離效率。方法:將第二章制備的三種溫度響應(yīng)性硼酸功能化納米顆粒,加入辣根過氧化物酶和牛血清白蛋白的混合蛋白樣品中,首先進(jìn)行溫度循環(huán)實驗,分析溫度對納米顆粒吸附糖蛋白的影響變化;然后在混合蛋白樣品中加入單糖再進(jìn)行溫度循環(huán)實驗,分析溫度與單糖聯(lián)合作用對納米顆粒吸附糖蛋白的影響。在此基礎(chǔ)上分析洗脫液pH、洗脫溫度、在洗脫液中加入單糖等因素單獨或聯(lián)合作用對糖蛋白洗脫的影響,確定糖蛋白洗脫的最佳條件。使用優(yōu)化的最佳糖蛋白洗脫條件,利用硼酸功能化納米顆粒分離純化混合蛋白溶液中的糖蛋白。最后使用SDS-PAGE電泳分析不同溫度響應(yīng)性硼酸功能化化納米顆粒對100倍稀釋的雞蛋蛋清中糖蛋白的吸附能力。結(jié)果:溫度循環(huán)實驗證明,通過簡單地改變?nèi)芤簻囟?可以控制硼酸功能化納米顆粒與混合樣品中糖蛋白的結(jié)合與釋放,且該結(jié)合-釋放可以循環(huán)進(jìn)行。果糖可與糖蛋白競爭硼酸功能化納米顆粒上的硼酸位點,加入果糖可以減少納米顆粒對糖蛋白的吸附量。將提高溫度、使用酸性洗脫液與添加果糖聯(lián)用,可以比單一條件更加有效地洗脫吸附于納米顆粒上的糖蛋白,分離純化糖蛋白與非糖蛋白混合樣品中的糖蛋白。SDS-PAGE結(jié)果表明,溫度響應(yīng)性硼酸功能化納米顆粒不僅可以分離純化混合蛋白樣品中的糖蛋白,還可以吸附雞蛋清中的糖蛋白。結(jié)論:溫度響應(yīng)性硼酸功能化納米顆�？梢杂糜诳刂铺堑鞍椎慕Y(jié)合與釋放。溫度循環(huán)實驗證明了硼酸-糖蛋白能夠形成可逆的酯鍵;可以通過簡單地改變溫度來控制控制硼酸與糖蛋白的結(jié)合。改變溫度的同時降低pH值并且添加果糖可以達(dá)到最好的糖蛋白回收效果。新型溫度響應(yīng)性硼酸功能化納米顆粒不僅可以用于糖蛋白分離,還可以用于藥物傳遞、藥物緩釋等。第四章基于點擊化學(xué)的糖蛋白分子印跡聚合物的制備與評價目的:本章探索利用點擊化學(xué)反應(yīng),在聚合物刷修飾的SiO_2納米顆粒表面制備對模板糖蛋白糖基構(gòu)成模式具有吸附特異性的糖蛋白分子印跡聚合物,提高對糖蛋白的吸附特異性。方法:(1)將炔基苯硼酸與模板糖蛋白(卵清蛋白)結(jié)合,得到炔基苯硼酸-卵清蛋白復(fù)合物。反應(yīng)后透析去除未結(jié)合蛋白的炔基苯硼酸;(2)利用炔基-疊氮基的點擊化學(xué)反應(yīng),將炔基苯硼酸-卵清蛋白復(fù)合物連接到SiO_2@PGMA-N_3@N_3,形成卵清蛋白-苯硼酸-納米顆粒復(fù)合物;(3)洗脫卵清蛋白,得到可以特異性識別卵清蛋白表面特定糖基模式的SiO_2@MIP。非印跡對照顆粒SiO_2@NIP的制備除在第一步反應(yīng)中不加入卵清蛋白外,其他步驟與SiO_2@MIP相同。對SiO_2@MIP與SiO_2@NIP進(jìn)行電鏡掃描、紅外光譜分析、硼酸功能化分析,并評價其對卵清蛋白的吸附性能。結(jié)果:卵清蛋白印跡的硼酸功能化納米顆粒SiO_2@MIP表面可以檢測到硼酸基團,而SiO_2@NIP表面未檢測到硼酸基團。SiO_2@MIP對卵清蛋白的吸附量顯著大于對糖蛋白辣根過氧化物酶與非糖蛋白牛血清白蛋白的吸附量;SiO_2@NIP對各種蛋白的吸附量類似。SiO_2@MIP對卵清蛋白的最大吸附容量(Q_(max)=110.03 mg/g)顯著大于SiO_2@NIP(Q_(max)=11.31 mg/g)。SiO_2@MIP對卵清蛋白的印跡因子(IF=8.12)顯著高于牛血清白蛋白(IF=2.88),也高于表面糖基構(gòu)成模式不同的辣根過氧化物酶(IF=5.17)。說明SiO_2@MIP可以特異性吸附模板蛋白卵清蛋白。SiO_2@MIP的特異性系數(shù)(K=1.73)高于第一章中所制備的硼酸功能化納米顆粒SiO_2@PGMA-BA@BA(K=1.32),說明通過糖蛋白分子印跡方式制備硼酸功能化納米顆�？梢蕴岣咛禺愋�。結(jié)論:本方法利用點擊化學(xué)反應(yīng),制備了對模板糖蛋白上特定糖基構(gòu)成模式具有吸附特異性的糖蛋白MIP。這種創(chuàng)新性的蛋白印跡方法為制備糖蛋白MIP提供了新思路。
【學(xué)位單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：TB383.1
【文章目錄】：
全文縮寫詞
摘要
Abstract
前言
第一章 硼酸功能化納米顆粒的制備及性能評價
    1.1 前言
    1.2 材料和方法
        1.2.1 主要試劑、儀器和溶液的配置
        1.2.2 兩種硼酸功能化納米顆粒的制備和表征
        1.2.3 兩種硼酸功能化納米顆粒表面的硼酸化水平分析
        1.2.4 兩種硼酸功能化納米顆粒在水溶液中的分散性分析
        1.2.5 兩種硼酸功能化納米顆粒對糖蛋白的吸附性能評價
    1.3 結(jié)果和討論
        1.3.1 兩種硼酸功能化納米顆粒的制備和表征
        1.3.2 兩種硼酸功能化納米顆粒表面的硼酸化水平分析
        1.3.3 兩種硼酸功能化納米顆粒在水溶液中的分散性分析
        1.3.4 硼酸功能化納米顆粒結(jié)構(gòu)和水溶液中分散性對其吸附糖蛋白性能的影響
    1.4 小結(jié)
第二章 溫度響應(yīng)性硼酸功能化納米顆粒的制備及性能評價
    2.1 前言
    2.2 材料和方法
        2.2.1 主要試劑、儀器和溶液的配置
        2.2.2 三種溫度響應(yīng)性硼酸功能化納米顆粒的制備和表征
        2.2.3 三種溫度響應(yīng)性硼酸功能化納米顆粒表面的硼酸化水平分析
        2.2.4 三種溫度響應(yīng)性硼酸功能化納米顆粒在水溶液中的分散性分析
        2.2.5 三種溫度響應(yīng)性硼酸功能化納米顆粒對糖蛋白的吸附性能評價
    2.3 結(jié)果和討論
        2.3.1 三種溫度響應(yīng)性硼酸功能化納米顆粒的制備和表征
        2.3.2 三種溫度響應(yīng)性硼酸功能化納米顆粒表面的硼酸化水平分析
        2.3.3 三種溫度響應(yīng)性硼酸功能化納米顆粒在水溶液中的分散性分析
        2.3.4 溫度響應(yīng)性硼酸功能化納米顆粒結(jié)構(gòu)和水溶液中分散性對其吸附糖蛋白性能的影響
    2.4 小結(jié)
第三章 溫度響應(yīng)性硼酸功能化納米顆粒用于糖蛋白分離
    3.1 前言
    3.2 材料和方法
        3.2.1 主要試劑、儀器和溶液的配置
        3.2.2 溫度對硼酸功能化納米顆粒吸附糖蛋白的影響
        3.2.3 溫度與單糖聯(lián)合作用對硼酸功能化納米顆粒吸附糖蛋白的影響
        3.2.4 硼酸功能化納米顆粒分離樣品中糖蛋白的洗脫條件優(yōu)化
        3.2.5 SDS-PAGE驗證硼酸功能化納米顆粒分離實際樣品中糖蛋白的性能
    3.3 結(jié)果與討論
        3.3.1 溫度控制硼酸功能化納米顆粒吸附混合蛋白樣品中的糖蛋白
        3.3.2 溫度與單糖聯(lián)合作用控制硼酸功能化納米顆粒吸附混合蛋白樣品中的糖蛋白
        3.3.3 硼酸功能化納米顆粒分離樣品中糖蛋白的洗脫條件優(yōu)化
        3.3.4 硼酸功能化納米顆粒分離混合蛋白樣品中的糖蛋白
        3.3.5 硼酸功能化納米顆粒吸附雞蛋清中的糖蛋白
    3.4 小結(jié)
第四章 基于點擊化學(xué)的糖蛋白分子印跡聚合物的制備與評價
    4.1 前言
    4.2 材料和方法
        4.2.1 主要試劑、儀器和主要溶液的配置
        4.2.2 基于點擊化學(xué)的糖蛋白MIP的制備
        4.2.3 糖蛋白MIP的表征
        4.2.4 吸附性評價
        4.2.5 統(tǒng)計學(xué)分析
    4.3 結(jié)果與討論
        4.3.1 基于點擊化學(xué)的糖蛋白MIP的制備與表征
        4.3.2 吸附性評價
    4.4 小結(jié)
結(jié)論
創(chuàng)新點與局限性
參考文獻(xiàn)
綜述
    參考文獻(xiàn)
附錄
致謝

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前3條

1 程華;李文強;石艷;周益平;方蘭鑫;;分子刷聚合物環(huán)境響應(yīng)特性及應(yīng)用的研究進(jìn)展[J];高分子通報;2015年12期

2 魏忠;侯華;;環(huán)境響應(yīng)性聚合物刷的制備與應(yīng)用[J];高分子通報;2012年05期

3 瞿亮,張國亮,張鳳寶;聚合物刷的合成與應(yīng)用研究進(jìn)展[J];化學(xué)工業(yè)與工程;2005年06期

本文編號：2877690