生物傳感技術(shù)是一門綜合了化學(xué)、信息學(xué)、生命科學(xué)等多種知識(shí)的交叉新興學(xué)科,因其具有成本低、選擇特異性、在線分析等眾多優(yōu)點(diǎn),近年被廣泛應(yīng)用于分析檢測(cè)、醫(yī)學(xué)診斷等領(lǐng)域。納米材料具有小尺寸效應(yīng)、量子尺寸效應(yīng)、表面效應(yīng)、宏觀量子隧道效應(yīng)一系列獨(dú)特性能,從而表現(xiàn)出異于常規(guī)材料的物理與化學(xué)性質(zhì),成為當(dāng)下研究熱點(diǎn)。納米材料的出現(xiàn)及其優(yōu)良性質(zhì)為生物傳感的技術(shù)研發(fā)開辟了一條新思路,二者巧妙結(jié)合,有力地推動(dòng)了化學(xué)分析、生命醫(yī)學(xué)與材料科學(xué)等多個(gè)領(lǐng)域的迅速發(fā)展。本論文基于熒光銅納米顆粒(CuNPs)與金屬有機(jī)框架材料(MOFs),構(gòu)建了三種響應(yīng)速度快、分析成本低的新型熒光生物傳感器,成功實(shí)現(xiàn)了對(duì)鉀離子(K~+)、人類免疫缺陷病毒(HIV)相關(guān)寡核苷酸序列、三磷酸腺苷(ATP)的有效檢測(cè)。具體內(nèi)容如下:(1)第2章,基于核酸適配體與其目標(biāo)物鉀離子之間的特異性識(shí)別,借助于核酸外切酶I(Exo I)和末端保護(hù)現(xiàn)象,通過熒光銅納米顆粒(CuNPs)的熒光信號(hào)強(qiáng)弱,構(gòu)建了一個(gè)免標(biāo)記、高靈敏度的鉀離子傳感器。首先,設(shè)計(jì)了一條包含兩部分的單鏈DNA(ssDNA),其3’端為K~+核酸適配體序列,5’端為熒光銅納米顆粒的合成模板聚T序列(poly T)。當(dāng)K~+與3’端核酸適配體相互識(shí)別時(shí),會(huì)誘導(dǎo)其發(fā)生折疊進(jìn)而形成G-四鏈體二級(jí)結(jié)構(gòu),該二級(jí)結(jié)構(gòu)能有效阻止Exo I對(duì)ssDNA從3’到5’端的水解,使得5’端poly T得以保留并為CuNPs的合成提供有效模板,體系可測(cè)到CuNPs的特征發(fā)射波長(zhǎng)。當(dāng)沒有K~+存在時(shí),3’端K~+核酸適配體不會(huì)發(fā)生結(jié)構(gòu)變化形成G-四鏈體,3’末端沒有二級(jí)結(jié)構(gòu)保護(hù),Exo I會(huì)將ssDNA水解成單個(gè)或很小的寡核苷酸碎片,因5’端poly T的合成模板被水解而無(wú)法合成CuNPs,體系熒光信號(hào)很低。該方法檢測(cè)限低,具有靈敏度高、特異性良好、低成本等優(yōu)點(diǎn),可潛在應(yīng)用于實(shí)際樣品檢測(cè)。(2)第3章,基于多孔型金屬有機(jī)框架材料(MOFs)對(duì)單、雙鏈DNA的吸附力顯著不同,設(shè)計(jì)了一個(gè)基于銅為金屬中心、均苯三甲酸為配體的金屬框架材料(Cu_3(BTC)_2)的新型熒光傳感器,用于檢測(cè)人類免疫缺陷病毒相關(guān)寡核苷酸序列,并探究了材料的降解性。由于π-π堆積,Cu_3(BTC)_2能特異性吸附ssDNA,并通過光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移(PET)效應(yīng)猝滅ssDNA上標(biāo)記的FAM熒光基團(tuán)。當(dāng)存在目標(biāo)序列時(shí),ssDNA雜交形成雙鏈DNA(dsDNA)時(shí),Cu_3(BTC)_2對(duì)dsDNA吸附力較小,使得dsDNA與Cu_3(BTC)_2作用后不會(huì)附著在材料表面,FAM熒光信號(hào)不會(huì)被猝滅,基于此構(gòu)建了一個(gè)可快速有效檢測(cè)HIV相關(guān)寡核苷酸序列的熒光傳感平臺(tái)。實(shí)驗(yàn)過程中還探究了材料Cu_3(BTC)_2的可降解性,利用氨基酸中羧基、氨基和Cu~(2+)的強(qiáng)配位能力,一定尺寸的氨基酸可通過MOFs表面的孔道進(jìn)入材料內(nèi)部,充分破壞Cu_3(BTC)_2內(nèi)金屬原子與有機(jī)配體之間的配位作用,實(shí)現(xiàn)對(duì)材料的降解,使得原本被吸附在Cu_3(BTC)_2表面的ssDNA被釋放出來(lái),被猝滅的FAM再度恢復(fù)熒光信號(hào)。該發(fā)現(xiàn)為快速檢測(cè)小尺寸氨基酸提供了潛在可能。(3)第4章,三磷酸腺苷(ATP)是生物體內(nèi)重要的能量?jī)?chǔ)存與轉(zhuǎn)換物質(zhì),被稱為能量傳遞的“分子貨幣”,同時(shí)也是S1核酸酶的抑制劑�；贏TP對(duì)S1核酸酶活性的抑制作用,結(jié)合S1核酸酶對(duì)ssDNA的特異性水解反應(yīng),我們利用CuNPs在602 nm處的熒光發(fā)射信號(hào),發(fā)展了一種可特異性檢測(cè)ATP的免標(biāo)記熒光傳感器。設(shè)計(jì)了一條由30個(gè)T堿基組成的ssDNA(T30),T30為CuNPs的有效合成模板,S1核酸酶會(huì)特異性水解ssDNA,使得CuNPs無(wú)法合成,體系熒光信號(hào)弱。當(dāng)ATP存在,會(huì)抑制S1核酸酶活性,T30得以保留并為合成CuNPs提供模板,此時(shí)可檢測(cè)到CuNPs的較強(qiáng)發(fā)射信號(hào)。體系熒光信號(hào)強(qiáng)度與ATP濃度呈正比關(guān)系,線性范圍為0-0.2 mM。實(shí)驗(yàn)表明該方法可成功應(yīng)用于特異性檢測(cè)ATP,且無(wú)需熒光標(biāo)記,DNA序列設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單,成本較低。
【學(xué)位單位】：湖南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：TB383.1;TP212.3
【部分圖文】：

免標(biāo)記雙波長(zhǎng)發(fā)射的生物傳感器比率型檢測(cè)DNA的示意圖

如圖1.2 所示，設(shè)計(jì)了兩條分子信標(biāo)（MB），MB1 和 MB2 其末端均修飾了巰基，利用 Au-S 鍵將 MB 固定于金納米顆粒（AuNP）表面，另一個(gè)末端則標(biāo)記了熒光基團(tuán)（MB1 標(biāo)記的 Alexa Fluor 488，MB2 標(biāo)記的 Cy3），此時(shí)兩條分子信標(biāo)保持發(fā)夾結(jié)構(gòu)，末端熒光基團(tuán)離 AuNP 很近，AuNP 紫外吸收帶較寬

圖 1.3 基于 CuNPs 檢測(cè)肌動(dòng)蛋白的熒光傳感器[52]）小分子的檢測(cè)Chen 等人[56]以 dsDNA-CuNPs 復(fù)合試劑為探針，結(jié)合 SYBR Green I 設(shè)計(jì)了檢測(cè) H2O2的方法，該方法還能延伸到其他物質(zhì)檢測(cè)，如膽固醇，辣根過氧化
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本文編號(hào)：2855319