肝癌是在我國仍是一種常見的惡性腫瘤,并且具有較高的死亡率。肝動脈化療栓塞術(Transarterial chemotherapy and embolization,TACE)是治療BCLC中期肝癌的一線治療手段。通過肝動脈插管造影,并且灌注的碘油栓塞腫瘤血供及化療藥物殺傷腫瘤細胞以控制腫瘤的進展。但TACE治療肝癌的效果目前仍不能令人滿意,在TACE中使用的化療藥物對于患者的生存期及腫瘤反應的作用存在爭議。多項臨床對照實驗表明,TACE的治療肝癌的效果與單純栓塞(Transhepatic Arterial Embolization,TAE)相比無明顯差異。在TACE中使用的化療藥物在腫瘤組織內分布不佳是導致其抗腫瘤效果不能令人滿意的主要原因之一。隨著納米醫(yī)學的發(fā)展,由于納米材料的表面可修飾性為藥物的靶向遞送帶來了廣闊的研究前景,裝載化療藥物的靶向基團修飾納米材料改善了抗腫瘤藥物在腫瘤組織內的攝取及分布,并增強了藥物的抗腫瘤效果。因此,基于以上存在問題及研究基礎,本研究以中空介孔納米二氧化鋯(ZrO_2)為載體,利用納米ZrO_2的中空結構裝載化療藥物阿霉素(DOX),以環(huán)狀RGD肽(iRGD)為靶向修飾分子,制備具有腫瘤主動靶向功能的ZrO_2納米藥物遞送系統(tǒng)(R-DZCNs),并探討其在肝癌TACE治療中的效果。研究方法:1.以納米二氧化硅球為模板,通過刻蝕法合成中空介孔結構納米ZrO_2。通過真空負壓法在納米ZrO_2的中空結構中裝載阿霉素。以EDC.NHS反應在ZrO_2納米材料的表面修飾腫瘤靶向肽iRGD。利用透射電鏡(TEM),動態(tài)光散射粒度儀(DLS),ZETA電位儀對合成的R-DZCNs的形態(tài)結構,粒徑分布,和表面電位進行分析。并對R-DZCNs材料中阿霉素在體外的釋放情況進行評估。2.將載阿霉素的非靶向二氧化鋯納米藥物(DZCNs),靶向納米藥物(R-DZCNs)與HepG2肝癌細胞共同孵育,通過CCK-8法檢測ZrO_2納米材料及R-DZCNs對細胞的毒性作用及增殖抑制作用。并通過共聚焦顯微鏡觀察R-DZCNs及DZCNs中阿霉素的熒光在細胞內的分布,比較它們在體外對HepG2肝癌細胞靶向性。3.動物實驗:分為阿霉素藥物腫瘤組織內分布實驗及抗腫瘤效果實驗。通過經皮穿刺種植法建立兔VX2肝臟腫瘤模型,并利用MRI掃描監(jiān)測VX2腫瘤的生長情況。在DSA的引導下行兔肝動脈插管,進行肝動脈造影及藥物灌注。在阿霉素組織中分布的研究中,分為DOX+Lipiodol組,DZCNs+Lipiodol組及RDZCNSs+Lipiodol組。在各組中分別經肝動脈給與碘油及阿霉素或DOZCs或R-DZCNs。在給藥10分鐘及4小時后,處死取瘤,通過免疫熒光對腫瘤血管染色,計算腫瘤內的阿霉素熒光點數(shù)及阿霉素組織穿透距離,從而評價阿霉素在VX2瘤內的攝取及分布情況。在抗腫瘤效果的研究中,將荷瘤兔分為對照組,DOX+Lipiodol組,DZCNs+Lipiodol組及R-DZCNSs+Lipiodol組。在對照組中經肝動脈給予生理鹽水作為對照,另外三組分別經肝動脈給予碘油及阿霉素或DZCNs或R-DZCNs。在治療后7天及14天分別通過磁共振掃描,監(jiān)測各組中腫瘤體積的變化情況。在最后一次掃描結束后,處死取瘤,通過免疫組化及蛋白印跡法監(jiān)測各組腫瘤組織內凋亡相關因子(Caspase-3,Bax,Bcl-2)的表達。并對重要臟器(心、肝、脾、腎、肺)行HE染色觀察,評估R-DZCNs的安全性。結果:1.合成的iRGD靶向納米藥物體系R-DZCNs電鏡下直徑約為165.2±8.2 nm,納米顆粒形狀相對均一。其水合粒徑約為230.1 nm,粒徑分布具有良好的均一性和穩(wěn)定性。當藥物投入量與納米比例為1:2時,藥物裝載率為20%,藥物包封率為50%。R-DZCNs中阿霉素在模擬腫瘤酸性環(huán)境下(PH=5.5),其24小時內的釋放率為37%。2.CCK-8結果顯示單純的ZrO_2納米材料在100ug/m L至400ug/m L的濃度范圍內對HepG2肝癌細胞均無明顯增殖抑制作用,表現(xiàn)出良好的生物相容性。在DNZCs與R-DZCNs對HepG2增殖抑制的比較中,在各個濃度梯度上,R-DZCNs表現(xiàn)出了比非靶向載藥納米材料更好的HepG2細胞增殖抑制作用(P0.05)。3.通過對非靶向組和靶向組細胞內熒光強度進行分析,發(fā)現(xiàn)R-DZCNs組細胞內阿霉素熒光強度明顯高于DZCNs組(159.52±23.76 vs 118.53±16.85,P=0.014)。4.在腫瘤內藥物分布的研究中,在給予肝動脈灌注碘油及DOX/DZCNs/R-DZCNs 10分鐘后,各組的阿霉素熒光點數(shù)未有明顯的差異(1417.60±353.82 vs1407.11±520.58 vs 1585.59±484.10,P0.05)。而在灌注4小時后,DOX+Lipiodol組,DZCNs+Lipiodo組及R-DZCNs+Lipiodol組的熒光點數(shù)分別為2469.15±554.14,3604.73±632.75及4462.25±585.62。R-DZCNs組的熒光點數(shù)明顯多于DOX+Lipiodol組DZCNs+Lipiodol(P0.05)。在給藥后10分鐘,DOX+Lipiodol組,DZCNs+Lipiodol組及R-DZCNs+Lipiodol組與血管的距分別為(33.75±7.3)mm,(27.36±8.13)mm及(34.78±10.04)mm,R-DZCNs與其他兩組相比未見明顯差異(P0.05)。阿霉素熒光點而在灌注4小時后,DOX+Lipiodol組,DZCNs+Lipiodol組及R-DZCNs+Lipiodol組阿霉素熒光點與血管的距離分別為58.64±14.53μm,83.37±13.76μm and 109.58±22.34μm,。R-DZCNs組的阿霉素熒光點與血管的距離明顯多于DOX+Lipiodol組及DZCNs+Lipiodol組,(P0.05)。5.在體內抗腫瘤效果的研究中,介入治療之前在對照組,DOX+Lipiodol組,DZCNs+Lipiodol組及R-DZCNs+Lipiodol組的VX2腫瘤體積分別為378.32±28.33mm3,352.89±38.85 mm3,416.1±44.29 mm,398.97±56.91 mm,(P0.05)。在治療后7天對照組,DOX+Lipiodol組,DZCNs+Lipiodol組及R-DZCNs+Lipiodol組,腫瘤體積分別為(3349.58±313.15)mm3,(1151.26±277.65)mm3,(758.71±223.12)mm3,(578.01±313.16)mm3,R-DZCNs+Lipiodol組的體積明顯低于對照組,DOX+Lipiodol組(P0.05),但與DNZCs+Lipiodol組無明顯差異(P0.05)。治療14天后,對照組,DOX+Lipiodol組,DZCNs+Lipiodol組及R-DZCNs+Lipiodol組中,體積分別為(8590.69±564.42)mm3,(3349.58±313.15)mm3,(2281.06±457.21)mm3,(1383.87±354.75)mm3,R-DZCNs+Lipiodol組的體積明顯小于其他三組(P0.05)。免疫組化分析中,Caspase-3染色在DOX+Lipiolol組,DZCNs+Lipiolol組及R-DZCNs+Lipiolol組中Caspase-3的表達率分別為對照組的2.2,3.4倍及5.7倍,在R-DZCNs+Lipiolol組中的表達明顯高于其他三組(P0.05)。而Bax分別為2倍,3.8倍及5.8倍,在R-DZCNs+Lipiolol組中的表達明顯高于其他三組(P0.05)。在阿霉素組,DZCNs組及R-DZCNs組中Bcl-2的表達分別是對照組的0.7倍,0.48倍及0.22倍,在R-DZCNs+Lipiolol組中的表達明顯低于其他三組(P0.05)。Western檢測的Caspase-3,Bax及Bcl-2在各組表達比較:在DOX+Lipiodol組,DZCNs+Lipiodol組及R-DZCNs+Lipiodol組中Caspase-3的表達率分別為對照組的1.7倍2.6倍及4.3倍,R-DZCNs+Lipiolol組中的表達明高于其他三組(P0.05)。而Bax分別為1.9倍2.5倍及3.2倍,在R-DZCNs+Lipiolol組中的表達明顯高于其他三組(P0.05)。在DOX組,DZCNs組及R-DZCNs組中Bcl-2的表達分別是對照組的0.8倍,0.6倍及0.3倍,在R-DZCNs+Lipiolol組中的表達明顯低于其他三組(P0.05)。6.心臟,脾臟,肝臟,肺臟,腎臟的蘇木精和伊紅染色(HE染色)切片未觀察到顯著的組織損傷或炎癥反應。結論:本研究成功合成了具有腫瘤細胞靶向功能的納米藥物系統(tǒng)R-DZCNs。在體外實驗中,R-DZCNs表現(xiàn)出了對腫瘤細胞良好的主動靶向性,表現(xiàn)出了更好的腫瘤細胞增殖抑制。在體內實驗中,將R-DZCNs應用在肝癌的介入治療中,通過經肝動脈給予碘油及R-DZCNs,可明顯增強阿霉素在腫瘤組織內的分布,增強了化療藥物在肝癌介入治療中的抗腫瘤效果。
【學位單位】：中國醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：R735.7;TB383.1
【部分圖文】：

3 結果3.1 中空介孔 ZrO2 的合成如圖 3.1a 所示，納米顆粒的尺寸及形態(tài)較為均一。通過粒徑分布計算軟件測量，合成的 ZrO2的粒徑平均為 165nm。利用動態(tài)光散射法測量 ZrO2的流體力學直徑為 209.nm，且粒徑分布較窄，表明成功的合成了顆粒均一的 ZrO2納米顆粒（圖 3.1b）。ZETA 電位儀測得 ZrO2的電位為 -38.4mV（圖 3.1c）。

電位-38mV.3.2 R-DZCNs 的的表征如圖3.2a 所示，R-DZCNs的流體動力學直徑分布特點與ZrO2納米顆粒相似，為230.9n，分布范圍較窄。在iRGD 表面修飾過程中，iRGD的羧基先被活化，再與ZrO2納米表面上的氨基反應而形成酰胺鍵，從而連接在ZrO2的表面。ZrO2納米初始ZETA電位為-38.2mV，在氨基化改性之后變?yōu)?24mV

103.3 鹽酸阿霉素的裝載與釋放如圖3.3.1所示，鹽酸阿霉素標準曲線計算公式為y=9.9729x+0.0754（y=吸光度值，單位是A.U.；x=鹽酸阿霉素的濃度，單位是ug.mL-1）。當鹽酸阿霉素與ZrO2納米材料的投入量為1:2時，阿霉素的包封率為50%，載藥率約為25%。在1h，2h，3h

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本文編號：2810387