【摘要】：羥基磷灰石(Hydroxyapatite:HAp)是人體骨骼和牙齒中主要的無機成分。相比于其他骨組織修復材料,HAp基生物材料能夠更好地誘導骨組織再生和修復,并且?guī)缀醪粫鹑魏胃弊饔?因此在骨組織工程中得到廣泛地應用。納米材料獨特的優(yōu)勢,如多的表面缺陷,大的比表面積以及其他獨特的物理性能,拓展了材料在組織工程領域中的應用。相比于塊體狀態(tài),納米磷酸鈣材料對細胞的粘附、增殖、分化以及骨組織愈合都具有更好的促進作用。因此,HAp納米晶結(jié)構的調(diào)控對于HAp基生物材料在組織工程中的應用起到非常重要的作用。雖然HAp納米晶形貌的調(diào)控和性能的優(yōu)化已經(jīng)得到廣泛地研究,但仍需進一步探索以滿足特定的應用需求。通過熒光可視化細胞的行為,對于在骨組織工程中研究修復材料與細胞的相互作用是非常重要的。此外,材料的納米結(jié)構對細胞行為具有明顯的影響。因此,制備具有優(yōu)異熒光性能的納米HAp以可視化細胞行為,以及制備具有合理結(jié)構的納米HAp并依靠納米結(jié)構的作用促進干細胞成骨分化,在骨組織工程中具有重要的意義。隨著人們對組織修復不斷提高的要求,傳統(tǒng)的單一材料通常難以滿足修復過程中的實際需求。復合材料往往具有兩種或多種材料的綜合優(yōu)勢,能夠達到最優(yōu)化的、目的性的組織修復。因此,復合材料成為目前組織工程領域的研究熱點。通過對納米HAp復合材料進行結(jié)構設計和性能優(yōu)化,能夠賦予HAp更多的功能,以充分的滿足復雜環(huán)境中組織修復的特定需求。傳統(tǒng)的HAp復合材料往往只是將幾種材料簡單的機械混合,喪失了獲得最佳性能的可能,從而無法充分發(fā)揮材料應有的優(yōu)勢。因此,通過合理的結(jié)構設計,使HAp復合材料具有更完備的功能,對于實現(xiàn)骨組織的精確修復和特殊性修復具有重要的意義�；谝陨蠁栴},本論文旨在以HAp為研究對象,通過對材料組成與結(jié)構的設計,以及對材料/細胞相互作用的深入理解,合成具有不同組成和形貌的納米HAp,從而研究組成、結(jié)構及表界面狀態(tài)對細胞的影響以實現(xiàn)不同的生物應用;同時,基于材料功能設計,通過組裝第二類材料,構建多功能化納米HAp復合材料,從而拓展HAp納米材料的應用。本論文主要包括以下四個方面的工作:(1)HAp熒光納米棒對細胞可視化成像及高效藥物傳遞通過溶劑熱法制備了具有優(yōu)異熒光性能的銪(europium)/鋱(terbium)雙摻氟化HAp(Eu/Tb FAp)納米棒和碳量子點-HAp(CQD-HAp)復合納米棒,并對兩類不同發(fā)光機制的HAp基熒光納米棒的合成及其與細胞的相互作用進行了研究。首先,利用雙摻雜稀土離子的協(xié)同作用,實現(xiàn)了 Eu/Tb FAp納米棒在單波長激發(fā)下的雙波長發(fā)射,并可對雙波長發(fā)光強度進行調(diào)控。Eu/Tb FAp納米棒具有均一的形貌,長度大約為200 nm。氟化能夠提高Eu/Tb FAp的熒光強度。通過Tb3+離子和Eu3+離子之間的部分能量轉(zhuǎn)移,Eu/Tb FAp納米棒在單一波長488 nm激發(fā)下同時發(fā)射綠色熒光和紅色熒光,通過接收不同的波段可以對細胞進行雙色熒光標記,以便于在復雜環(huán)境中標記和追蹤細胞,并且可以通過熒光可視化觀察細胞對納米棒的內(nèi)吞作用。由于FAp的降解速率低,因此合成了稀土-氨基酸熒光納米晶用來驗證稀土元素Eu和Tb對細胞的安全性。結(jié)果表明,稀土元素(Tb和Eu)對細胞的毒性很低。因此,Eu/Tb FAp納米棒在降解后對細胞不會產(chǎn)生明顯的副作用,從而進一步證明了 Eu/Tb FAp納米棒高的生物安全性。其次,利用碳量子點的熒光性能和HAp納米棒的攜帶鍵和作用,合成了CQD-HAp復合納米棒。CQD-HAp復合納米棒長度約為100 nm,寬度約為15 nm。CQDs表面與發(fā)光性能密切相關的官能團和HAp通過配合鍵形式結(jié)合,使CQDs在細胞內(nèi)受到一定程度的保護,從而使CQD-HAp復合納米棒具有比CQDs更長的熒光壽命。復合納米棒表面具有大量介孔,對阿霉素(Dox)有強的吸附能力,可作為良好的藥物載體。相比于當量濃度的純Dox,Dox-CQD-HAp復合納米棒對HeLa細胞具有更強的致死性。優(yōu)異的熒光性能拓展了 HAp納米棒在細胞成像,標記追蹤,內(nèi)吞作用可視化觀察,藥物傳遞和釋放可視化觀察等方面的應用,對探究細胞行為以及細胞和納米材料的相互作用具有重要的意義。(2)長度可調(diào)一維HAp納米晶構建納米地貌調(diào)控干細胞成骨分化調(diào)節(jié)溶劑比例,通過溶劑熱法制備了長度可調(diào)的一維(1D)HAp納米晶,探究了不同納米結(jié)構形成的襯底地貌對干細胞成骨分化的影響。在相同的反應體系中,溶劑比例(乙醇/水)可以調(diào)控1D HAp納米晶的長度。所制備的1D HAp納米結(jié)構具有相同的表面性質(zhì)和結(jié)晶生長方向,這為單一化研究納米結(jié)構對干細胞行為的影響提供了保障。不同的1D HAp納米結(jié)構對細胞的形貌,粘附,伸展和偽足狀態(tài)具有不同的影響,甚至對細胞活性也具有明顯的調(diào)控作用。細胞在短納米線(5μm)和納米棒(100 nm)襯底上具有良好的活性,而在長HAp納米線(50μm)襯底上,細胞活性明顯的降低。且在無誘導因子的條件下,短納米線能夠明顯成骨相關基因和蛋白的表達。因此,HAp短納米線涂層僅僅通過結(jié)構的作用就能夠有效地促進干細胞的成骨分化。此外,HAp納米棒涂層只能較低程度地促進干細胞的成骨分化。這種不引入生長因子只依賴納米結(jié)構調(diào)控干細胞成骨分化的方式對干細胞工程和骨組織工程都具有重要的意義,也對于其他生物材料表面涂層的設計具有一定的指導意義。(3)HAp納米線/聚乳酸雙面神膜:骨誘導再生/屏障雙功能用于骨組織精確修復通過合理的結(jié)構設計,利用一種簡單高效的方法制備了具有骨誘導再生和屏障雙功能的HAp納米線/聚乳酸(HAp/PLA)雙面神膜,其目的是克服生物材料在骨修復過程中骨誘導再生和周圍組織粘連的矛盾。首先制備長度約為20μm的HAp納米線,通過抽濾制備成HAp納米線紙。然后利用擴散-蒸發(fā)自成膜的方法制備具有兩面不同材料的HAp/PLA復合膜。利用HAp的親水性和PLA的疏水性,賦予HAp/PLA雙面神膜兩面兩種不同的性質(zhì):親水HAp面能夠促進細胞的粘附、生長和成骨分化,而疏水PLA面能夠阻止細胞的粘附和生長。CCK-8細胞活性檢測和活/死細胞染色結(jié)果表明,細胞僅在雙面神膜HAp面生長和粘附,并且HAp面能夠有效地促進干細胞的成骨分化;而在PLA面,細胞無法粘附和生長,從而起到屏障的作用。q-PCR結(jié)果證明雙面神膜HAp面能夠促進成骨相關基因的表達。ALP測試結(jié)果和免疫熒光染色結(jié)果證明HAp面能夠促進成骨相關蛋白的表達。體內(nèi)實驗證明,HAp/PLA雙面神膜的HAp面能夠有效地誘導骨再生,而PLA面能夠阻止新生骨和周圍軟組織之間的術后黏連。HAp/PLA雙面神復合膜既能夠阻止組織修復后的術后黏連,又能夠有效的促進骨再生,并且制備流程簡單,成本低,易于實際的推廣和應用。因此,結(jié)構優(yōu)化的HAp/PLA雙面神膜將會在骨組織的精確修復中起到積極地促進和指導作用。(4)HAp納米線/聚乳酸雙面神膜負載銅-半胱氨酸納米顆粒用于骨癌術后組織修復通過金屬-氨基酸配合作用,大規(guī)模制備了銅-半胱氨酸納米顆粒(Cu-Cys NPs)。Cu-Cys NPs組成為人體所需的氨基酸和銅離子,因此降解之后對身體不會引起明顯的副作用。被細胞攝取后,Cu-Cys NPs先和細胞內(nèi)GSH發(fā)生反應,產(chǎn)生Cu+;然后Cu+再和H2O2發(fā)生類芬頓反應產(chǎn)生具有強攻擊性的羥基自由基(.OH),從而引起癌細胞的凋亡。Cu-Cys NPs和胞內(nèi)的GSH、H2O2發(fā)生級聯(lián)化學動力學反應,既能夠消耗還原物質(zhì)GSH,又能產(chǎn)生·OH,使得Cu-Cys NPs對癌細胞具有高的致死性。此外,動物實驗結(jié)果證明,Cu-Cys NPs能有效抑制耐藥性腫瘤的生長,并且不會引起體內(nèi)的系統(tǒng)性毒性。將Cu-Cys NPs負載于HAp納米線上,按照雙面神膜的制備流程,獲得Cu-Cys NPs/HAp/PLA多功能性復合膜。復合膜的Cu-Cys NPs/HAp面對癌細胞仍然具有高的致死性。因此,復合膜既可以精確修復骨癌術后引起的骨缺損,同時又可以殺死可能殘留的癌細胞,抑制癌癥復發(fā)。因此,Cu-Cys NPs/HAp/PLA多功能性復合膜將會在骨癌引起的組織缺陷修復中具有巨大的潛力,同時也為其他癌癥引起的組織缺損的修復起到一定的導向作用。綜上所述,本論文制備了結(jié)構和性能優(yōu)化的HAp納米晶以及基于HAp納米晶的新型復合材料,并對材料的性能和應用進行了深入的研究。熒光HAp納米棒能夠可視化內(nèi)吞過程以及藥物的傳遞和釋放,以觀察納米顆粒和細胞的相互作用。不同長度1D HAp構建的納米地貌能夠在無誘導因子輔助下顯著地促進干細胞的成骨分化,為HAp材料在骨組織工程中的實際應用提供了巨大的便利。結(jié)構設計合理的、具有骨誘導再生/屏障雙功能的HAp/PLA雙面神膜為骨組織的精確修復提供新的解決方案。此外,將新型抗癌納米制劑Cu-Cys NPs負載于HAp納米線上,在雙面神膜基礎上獲得Cu-Cys NPs/HAp/PLA多功能性復合膜,以應用于骨癌術后引起的骨組織缺陷修復。
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：TB34;R318.08
【圖文】：

進行評價的重要參考依據(jù)。因此，骨組織修復材料對干細胞行為尤其是成骨分逡逑化的影響，是評價材料促進骨再生和修復的一項重要標準。逡逑干細胞對材料的各種響應（圖１－１），如細胞的粘附，伸展，遷移等行為，逡逑是分析材料－細胞復合系統(tǒng)的重要參考因素［７７－７９］。干細胞的粘附和遷移狀態(tài)對逡逑其定向分化具有重要的調(diào)控作用。細胞行為的分析，不僅可以用來研究干細胞逡逑和材料的相互作用，同時也為干細胞外特定微環(huán)境構建以及體內(nèi)組織修復提供逡逑了論證和基礎。逡逑Ｍａｔｒｉｘ邋＼邋＼逡逑ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ邋＼＼逡逑．＼逡逑＾邐Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｎｉｃｈｅ邋ｓｉｇｎａｌｓ逡逑Ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ逡逑ｆｏｒｃｅｓ邐ｊ邐Ｃｅｌｌ逡逑Ａｌｔｅｒｅｄ邋ｇｅｎｅ邋ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ逡逑／邋ｉ邋＼逡逑Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ邋Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ邐Ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ逡逑圖１－１細胞對材料的響應［７９］逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１－１邋Ｔｈｅ邋ｒｅｓｐｏｎｓｅ邋ｏｆ邋ｃｅｌｌｓ邋ｔｏ邋ｍａｔｅｒｉａｌ逡逑細胞粘附和遷移是貼壁細胞進行一切后續(xù)行為的基礎。所有的組織修復逡逑（包括骨組織修復）過程中，細胞在體內(nèi)的徖移對組織的修復是至關重要。當逡逑組織發(fā)生受損時，只有足夠數(shù)量的千細胞和其他所需功能性細胞聚集到損傷處，逡逑才能夠?qū)κ軗p的組織和器官進行有效的修復。針對于此，通過熒光納米材料可逡逑視化追蹤細胞得到了廣泛的研究。熒光納米材料可視化追蹤，可以方便的觀察逡逑到細胞遷移和募集的過程

邐ｃ°ｌ＾＇邐ＰＴＴ邋ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ逡逑ｊ邐Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ邐Ｋｕｃ，ｅｕｓ逡逑圖１－３光熱和光動力化學治療癌癥［９０］逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１－３邋Ｐｈｏｔｏｔｈｅｒｍａｌ邋ａｎｄ邋ｐｈｏｔｏｄｙｎａｍｉｃ邋ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ邋ｆｏｒ邋ｃａｎｃｅｒ逡逑１．３磷酸鈣骨組織工程修復材料逡逑ａ邋Ｉ邋／＊－？’？？？邐：邐邐￣邋．‘邋邋邐ｐ￣￣邐觸０福逡逑？邐１邐？邐＾邐？邐Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ逡逑？？邐？？NB邐’．邐Ｐｒｏｔｅｉｎ邐Ｍａｔ呶逡逑？邋ｎＡＣＰ邐Ｔｉ邋ｉｍｐｌａｎｔ邐ｖ邋’’邋一邋Ｋ逡逑＿＿ｌ－－－－邋■＂■＿－．■：■－■邐■邋—邐邋＾邐Ｃｅｌｌ逡逑Ｃ邐ｒｅｃｅ＾ｏｒｓ逡逑？邋＊邋？邐．邋，邋ａ邐４邋－邋Ａ邐？邋４邋９邋＊邋￣逡逑＜邐Ｔ邋＊邋１邐ｉ邋？＊？逡逑？邋？？？”＊．？？邐？？

邐Ｔｉ邋ｉｍｐｌａｎｔ逡逑圖１－４磷酸鈣材料和細胞的相互作用［９２］逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１－４邋Ｔｈｅ邋ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ邋ｂｅｔｗｅｅｎ邋ｃａｌｃｉｕｍ邋ｐｈｏｓｐｈａｔｅ邋ｍａｔｅｒｉａｌｓ邋ａｎｄ邋ｃｅｌｌｓ逡逑磷酸鈣骨組織修復材料由于具有良好的骨誘導性，人體自洽性，低免疫性，逡逑可降解性等優(yōu)勢，在骨組織工程中得到廣泛地應用。磷酸鈣納米顆粒，磷酸鈣逡逑陶瓷，磷酸鈣多孔支架，以及a愃岣疲謝牧細春現(xiàn)Ъ艿然諏姿岣頻牟煌噱義閑偷墓切薷床牧弦丫玫焦惴旱難芯�。不同类型的磷酸钙材溜@詮親櫓こ討繡義暇哂脅煌撓τ

本文編號：2752946