【摘要】：角蛋白酶是一類可降解角蛋白的特殊蛋白酶,能作用于多種角蛋白底物,具有底物寬泛性,在醫(yī)藥、飼料、紡織等領(lǐng)域具有重要應(yīng)用前景,其市場需求正在不斷提升。但目前多數(shù)角蛋白酶的酶活、應(yīng)用性能等還無法滿足商業(yè)化應(yīng)用要求,迫切需要挖掘更多優(yōu)質(zhì)角蛋白酶,并通過基因工程改造實現(xiàn)以角蛋白酶的高效表達及性能優(yōu)化。為此,本研究從角蛋白酶基因挖掘、高效表達、熱穩(wěn)定性改造及其在銀納米粒子制備中的應(yīng)用研究等方面開展了一系列工作。主要研究內(nèi)容如下:(1)本論文首先從富含角蛋白的環(huán)境樣品宏基因組DNA中挖掘獲得一個角蛋白酶基因kerBv,該基因全長1149 bp,編碼382個氨基酸。先將該基因在大腸桿菌中進行異源表達,目的蛋白為胞內(nèi)酶,對宿主細胞傷害較大,非包涵體的活性表達酶活為40.9U/mL�？莶菅挎邨U菌具有優(yōu)秀的蛋白分泌能力,通過組裝信號肽成功實現(xiàn)了重組角蛋白酶的胞外分泌表達,發(fā)酵液中最高酶活為164.8 U/m L。酶學(xué)特性研究顯示,該角蛋白酶的最適反應(yīng)溫度為60℃,最適反應(yīng)pH為10.0,并具有水解多種角蛋白的底物寬泛性。(2)為繼續(xù)提升該重組角蛋白酶的表達水平和應(yīng)用潛力,本研究采用啟動子工程和培養(yǎng)基優(yōu)化來實現(xiàn)枯草芽孢桿菌中重組角蛋白酶的高效表達。啟動子是影響目的基因表達的關(guān)鍵因素,選擇合適的啟動子有助于實現(xiàn)重組蛋白的高效表達。本論文成功構(gòu)建了攜帶16種不同啟動子序列的角蛋白酶重組菌,7株重組菌產(chǎn)酶水平顯著提升,其中PaprE啟動子適配性改造重組菌的酶活水平最高,達到2605 U/m L,是對照菌酶活的20倍。以添加15 g/L甘油的TB培養(yǎng)基進行5 L發(fā)酵罐產(chǎn)酶研究,結(jié)果顯示發(fā)酵至36 h時,發(fā)酵液中角蛋白酶活力高達7176 U/mL,是目前文獻報道的重組角蛋白酶表達的最高水平,為角蛋白酶的實際應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。(3)角蛋白酶kerBv的熱穩(wěn)定性較差,其在60℃的半衰期為14.7 min。為提高重組角蛋白酶的熱穩(wěn)定性,利用理性設(shè)計策略尋找潛在的關(guān)鍵位點進行突變改造。構(gòu)建角蛋白酶三維同源模型,在模型上選取了高柔性Loop區(qū)域中8個位點進行定點突變改造研究。對各重組酶突變體進行熱穩(wěn)定性評估,結(jié)果顯示,N218S突變酶的熱穩(wěn)定性顯著提高,其在60℃的半衰期延長至50.6 min,為初始酶半衰期的3.4倍。(4)角蛋白酶kerBv表現(xiàn)出較強的還原力,該還原力源于對角蛋白中二硫鍵的還原作用。在前期改造的基礎(chǔ)上,本研究利用強還原力的角蛋白酶進行銀納米粒子的生物合成探究。經(jīng)制備條件的系統(tǒng)優(yōu)化,在1.0 mM AgNO_3濃度下,添加200 U角蛋白酶,反應(yīng)48 h可制備出穩(wěn)定的銀納米顆粒。該銀納米粒子顆粒完整、粒徑范圍為3-15 nm,在420 nm處有特征吸收峰,Zeta電位值為-22 mV。抑菌結(jié)果顯示,100μg/m L銀納米粒子具有較好的抑菌活性。
【圖文】：

第一章 緒論第一章 緒論概述一種硬性纖維蛋白，在自然界中廣泛存在，具有不溶性、強抗的差異，角蛋白可分為 α-角蛋白和 β-角蛋白（圖 1-1）。羊毛、成，而羽毛則主要由 β-角蛋白構(gòu)成[1-3]。由于分子中存在大量，角蛋白不溶于水，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，很難被普通蛋白酶所降解

圖 1-2 不同角蛋白酶水解胰島素 B 鏈的切割位點Fig. 1-2 Cleavage sites of various keratinases as revealed by insulin B chain hydrolysis1.1.3 角蛋白酶的熱穩(wěn)定性研究角蛋白酶在實際應(yīng)用中通常需要加熱來加速反應(yīng)，且角蛋白酶粉制備時的噴霧干燥過程也需要加熱，因此，熱穩(wěn)定的角蛋白酶在實際應(yīng)用中非常重要。提高酶熱穩(wěn)定性的方法包括添加保護劑、酶的化學(xué)修飾、固定化以及蛋白質(zhì)工程改造等[29]。圖 1-3 所示為提高酶熱穩(wěn)定性的蛋白質(zhì)工程改造方法�；诘鞍踪|(zhì)三維結(jié)構(gòu)的定點突變改造是改變酶熱穩(wěn)定性的有效方法，近年來，建立在分子信息學(xué)基礎(chǔ)上的蛋白質(zhì)工程技術(shù)獲得了長足的發(fā)展，基于蛋白質(zhì)的晶體結(jié)構(gòu)或同源模型，利用計算機輔助設(shè)計能對角蛋白酶進行半理性或理性的蛋白質(zhì)工程改造，為提高角蛋白酶的熱穩(wěn)定性提供可行的技術(shù)手段。美國國立生物技術(shù)信息中心（NCBI）和蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（PDB）中存在角蛋白酶保守位點和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)等信息，通過對信息的初步檢索、分析以及進行計算機預(yù)測，確定熱穩(wěn)定性改造的潛在位點，進而構(gòu)建突變體，進行體外實驗驗證，考察重組酶的表達情況及其熱穩(wěn)定性。對穩(wěn)定性提高的突變體進一步計算分析以闡明其熱穩(wěn)定性提高的分子機制[30]，如
【學(xué)位授予單位】：江南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：Q55;TB383.1

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本文編號：2669867