【摘要】：納米技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景,是科研工作者們關(guān)注的熱點。在目前研究較多的納米材料和復(fù)合物中,金納米顆粒易于表面修飾,具有良好的生物相容性,優(yōu)秀的光學(xué)、熱學(xué)和電磁學(xué)特性,還能夠被制成多種形狀,自身特性又隨著其形狀和大小的改變而改變,在靶向性成像和腫瘤治療的方面具有可觀的應(yīng)用研究價值。胰腺導(dǎo)管內(nèi)腺癌(Pancreatic ductal adenocarcinoma,PDA),是全球性的惡性腫瘤。胰腺癌患者早期沒有明顯的癥狀和體征,絕大多數(shù)患者在確診時都已是晚期,錯過了手術(shù)治療時機(jī),而胰腺癌對其他臨床治療手段又不敏感,故預(yù)后較差。胰腺癌患者五年生存率為5%左右。本文利用化學(xué)溶液反應(yīng)的方法制備兩種金納米復(fù)合材料,并研究其在胰腺癌的診斷和腫瘤治療中的初步應(yīng)用。課題組的遠(yuǎn)期目標(biāo)是將不同的金納米材料進(jìn)行優(yōu)化組合,最終得到一類診療一體的納米復(fù)合物。第一部分目的:制備結(jié)合有GPC-1抗體的金納米簇復(fù)合物Gd-Au-NC-GPCAb-1,觀察該復(fù)合物的表征及生物相容性,并通過將該復(fù)合物應(yīng)用于離體胰腺癌細(xì)胞和裸鼠皮下胰腺癌移植瘤模型的靶向?qū)嶒?分析其作為診斷胰腺癌的熒光成像(Fluorescence Imaging,FI)和磁共振成像(Magnetic Resonance Imaging,MRI)雙模態(tài)靶向性成像納米探針的可行性。實驗方法:一、Gd-Au-NC-GPCAb-1的制備先用生物礦化法合成載釓納米金簇Gd-Au NCs,再其表面修飾GPC-1抗體,制備雙模態(tài)靶向性納米復(fù)合物Gd-Au-NC-GPCAb-1,觀察該復(fù)合物的形態(tài)特征和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性,測量該復(fù)合物的磁共振弛豫率等實驗值。二、Gd-Au-NC-GPCAb-1的毒性實驗把不同濃度(0~150mg/L)的Gd-Au-NC-GPCAb-1溶液和Gd-Au NC溶液分別與人類胰腺癌細(xì)胞株COLO-357和人類正常腎上皮細(xì)胞株293T一起培養(yǎng)孵育,通過CCK-8試劑盒檢測不同組別兩種細(xì)胞的存活情況;對經(jīng)靜脈分別注射納米復(fù)合物和生理鹽水24h后的裸鼠的心臟、肝臟、腎臟、脾臟和肺進(jìn)行切片HE染色,觀察對比注射后這些臟器的組織學(xué)改變;提取靜脈注射納米復(fù)合物24h后的裸鼠血液樣本進(jìn)行生化檢測。三、Gd-Au-NC-GPCAb-1的成像實驗建立裸鼠胰腺癌移植瘤模型:取濃度為5×10~6/mL的COLO-357細(xì)胞懸液,注射于雌性4至5周齡裸鼠右側(cè)腋部,待瘤灶生長至60mm~3大小時,挑選出若干只裸鼠切取腫瘤樣本做免疫組化檢測。體外培養(yǎng)COLO-357細(xì)胞和293T細(xì)胞,將兩種細(xì)胞懸液分別與未連接抗體的Gd-Au NCs和Gd-Au-NC-GPCAb-1一起孵育培養(yǎng)24h。用共聚焦顯微鏡觀察納米復(fù)合物與細(xì)胞的吸附結(jié)果;再使用胰酶分別消化兩種細(xì)胞,分別與未連接抗體的Gd-Au NCs及Gd-Au-NC-GPCAb-1納米復(fù)合物一起孵育培養(yǎng)1h,然后取樣進(jìn)行流式細(xì)胞實驗。將移植瘤模型動物經(jīng)腹腔注射麻醉后分兩批,一批在IVIS Lumina II小動物活體光學(xué)成像系統(tǒng)下進(jìn)行FI,另一批在西門子3.0T磁共振掃描儀下進(jìn)行MRI。將每一批的荷瘤裸鼠隨機(jī)分三組,經(jīng)尾靜脈分別注射0.2mL的生理鹽水、未連接抗體的Gd-Au NCs溶液及Gd-Au-NC-GPCAb-1溶液,對比注射不同溶液前后裸鼠移植瘤的熒光圖像和MR圖像。測量注射后10min,30min和40min移植瘤部位的熒光強(qiáng)度,觀察注射后10min,30min,60min和120min的移植瘤部位的T2WI信號值。結(jié)果:一、Gd-Au-NC-GPCAb-1的制備Gd-Au-NC-GPCAb-1納米復(fù)合物成功制備,顆粒大小均勻一致,穩(wěn)定性好;復(fù)合物的橫向弛豫率(r2)與縱向弛豫率(r1)的比值處于合適范圍內(nèi),說明該納米復(fù)合物可以作為MRI陽性對比劑。二、Gd-Au-NC-GPCAb-1的毒性實驗不同濃度的Gd-Au NCs對兩種細(xì)胞均沒有表現(xiàn)出明顯毒性作用;Gd-Au-NC-GPCAb-1對293T細(xì)胞也沒有表現(xiàn)出毒性作用,但對于胰腺癌細(xì)胞具有濃度依賴性的毒性。注射復(fù)合物溶液后不同實驗中裸鼠器官的HE染色結(jié)果無明顯差異;裸鼠血液樣本的生化檢測結(jié)果同樣顯示兩組動物沒有明顯差異。以上結(jié)果說明復(fù)合物的生物相容性良好。三、Gd-Au-NC-GPCAb-1的成像實驗免疫組化染色和IOD值測定都顯示GPC-1在胰腺癌腫瘤組織的表達(dá)明顯高于鄰近的正常組織。COLO-357細(xì)胞與Gd-Au-NC-GPCAb-1孵育之后,可在細(xì)胞表面能夠觀察到較強(qiáng)的紅色熒光信號,且Gd-Au-NC-GPCAb-1與COLO-357細(xì)胞的結(jié)合率最高。經(jīng)荷瘤鼠尾靜脈注射Gd-Au-NCs后,動物移植瘤部位的熒光強(qiáng)度逐漸升高,在10min時達(dá)最高,之后的30min緩慢降低。而注射Gd-Au-NC-GPCAb-1之后,動物移植瘤部位的熒光強(qiáng)度逐漸升高并在30min時達(dá)到峰值,之后的10min內(nèi)降低。荷瘤裸鼠注射Gd-Au-NC-GPCAb-1后,移植瘤的MR信號值逐漸升高,在大約30 min時升到最高。而注射Gd-Au NCs后的移植瘤信號是在60min內(nèi)緩慢升高,并在這之后的60min內(nèi)緩慢降低。結(jié)論:納米復(fù)合物Gd-Au-NC-GPCAb-1成功制備,結(jié)構(gòu)穩(wěn)定,生物相容性好。Gd-Au-NC-GPCAb-1能夠與COLO-357細(xì)胞靶向性結(jié)合;靜脈注射Gd-Au-NC-GPCAb-1后的裸鼠移植瘤部位的熒光圖像強(qiáng)度和磁共振T2WI圖像信號顯著升高。因此Gd-Au-NC-GPCAb-1對特異性表達(dá)GPC-1的胰腺癌細(xì)胞和組織具有良好體內(nèi)外靶向作用。第二部分目的:合成由氧化石墨烯(Graphene Oxide,GO)和金納米棒(Gold Nanorod,GNR)構(gòu)成的納米復(fù)合物(GO/GNR),觀察該納米復(fù)合物的表征及生物相容性,并將其應(yīng)用于裸鼠皮下胰腺癌移植瘤的微波消融實驗,分析其作為微波消融的熱增敏劑的可行性。實驗方法:一、GO/GNR的制備參考本課題組的過往研究,我選用一種晶種介導(dǎo)生長法制備GO/GNR納米復(fù)合物。先用聚苯乙烯磺酸鈉(Polystyrene Sulfonate,PSS)修飾GO形成GO-PSS,后在其表面添加金的晶種,晶種逐漸完成生長形成金納米棒,得到GO/GNR。二、GO/GNR的表征測定和毒性實驗我將通過透射電鏡,掃描電鏡和X射線光電子能譜儀等儀器來測定復(fù)合物的形態(tài)學(xué)特征。將不同濃度(0~200mg/L)的GO/GNR溶液與人類腎上皮細(xì)胞株293T一起培養(yǎng)孵育24h,通過CCK-8試劑盒測定細(xì)胞的存活情況;對分別靜脈注射納米復(fù)合物和PBS溶液24h后的裸鼠的心臟、肝臟、腎臟、脾臟和肺進(jìn)行切片HE染色,觀察注射后對比這些動物臟器的組織學(xué)改變。三、GO/GNR的胰腺癌微波消融熱增敏實驗我運用與課題第一部分相同的方法建立動物模型。在瘤灶生長超過100mm~3大小時,選取合適的動物,分為3組,處理方法分別為,直接進(jìn)行單純微波消融,先瘤內(nèi)注射0.2mL生理鹽水后再進(jìn)行微波消融,瘤內(nèi)注射0.2mLGO/GNR溶液后再行微波消融,消融功率為(10W,2min)。對比不同組的裸鼠消融后的瘤灶MRI圖像,測量冠狀位和橫斷位下消融灶的最大徑。結(jié)果:一、GO/GNR的制備GO/GNR納米復(fù)合物成功合成。二、GO/GNR的表征測定和毒性實驗觀察發(fā)現(xiàn)GO/GNR的形態(tài)規(guī)則,結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。XPS能譜分析的結(jié)果表明GO與GNR的結(jié)合是基于共價鍵的形式,而非π π堆積作用。CCK-8實驗結(jié)果表明,GO/GNR對293T細(xì)胞僅存在較低的毒性,僅在金濃度為200mg/L的時候有一定表現(xiàn)。裸鼠臟器的HE染色結(jié)果顯示兩組動物的所有器官沒有明顯的差異。三、GO/GNR的胰腺癌微波消融熱增敏實驗MRI圖像顯示,經(jīng)瘤內(nèi)注射GO/GNR溶液后的裸鼠移植瘤灶經(jīng)過微波消融后的消融面積較另外兩組大,具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。而注射生理鹽水組和直接消融組的消融面積沒有顯著的差異(P0.05)。表明了GO/GNR確實有一定的微波熱增敏效應(yīng)。結(jié)論:第二部分實驗合成GO/GNR納米復(fù)合物,同樣具有良好的穩(wěn)定性和生物相容性。裸鼠胰腺癌移植瘤模型上進(jìn)行的實驗結(jié)果證明,如果將該復(fù)合物于微波消融前注入腫瘤內(nèi),其能夠在消融過程中產(chǎn)生一定的熱增敏效應(yīng),使有效消融范圍增大。該復(fù)合物同樣有望在未來用于臨床上的腫瘤微波消融治療。
【圖文】：

金納米復(fù)合物的合成及其胰腺癌靶 性成 和微波熱增敏效應(yīng)的實驗研究2、連接抗體利用 EDC 作為催化劑將抗體與上一步中合成的 Gd-Au NC 連接[35]。方法如下：（1）取 30mg 已經(jīng)合成的 Gd-Au NCs 溶解于 900μL PBS 溶液中，另取 10mg固態(tài) EDC 溶解于 100μLPBS 溶液中。（2）將兩種溶液在室溫下混合，，放入超聲波清洗機(jī)處理 5min。（3）加入 30μLGPC-1 抗體溶液，將混合液置于室溫下避光攪拌 2h。（4）將混合液以 4000rpm 的轉(zhuǎn)速離心 20min 濾過，用 PBS 溶液清洗三次，便得到 Gd-Au-NC-GPCAb-1 固體。將其溶解于超純水中備用。

Gd-Au-NC-GPCAb-1的表征及Gd-AuNC的部分表征
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍海軍軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R735.9;TB383.1

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本文編號：2666179