【摘要】：次氯酸(HClO)是一種具有強氧化性的不穩(wěn)定弱酸,常溫下僅存在于水溶液中。在日常生活中一般作為漂白劑、氧化劑、消毒劑使用。次氯酸作為皮膚用消毒劑,可以安全面迅速地殺滅臨床上常見的細菌、真菌、芽孢桿菌和病毒,是一種非抗生素類的廣譜殺菌劑,在低濃度條件下即可顯示良好的殺菌效果。將人體內(nèi)源性物質(zhì)次氯酸制備成液體敷料,應(yīng)用于皮膚軟組織感染、皮膚機械性損傷傷口、手術(shù)切口,以此來實現(xiàn)殺菌消毒以及促進傷口愈合的作用。本文首先通過Sephadex G-150凝膠過濾柱和CM-Cellulose離子交換層析柱從新鮮豬血白細胞中提取髓過氧化物酶(MPO),通過紫外分光光度計對MPO提純物在200～560nm波長范圍內(nèi)進行掃描,定性鑒別,通過不連續(xù)緩沖液系統(tǒng)SDS-PAGE凝膠電泳鑒定MPO的分子量,通過MPO測試盒測定MPO酶的活性,通過Bradford法測定MPO的蛋白濃度。通過實驗室化學(xué)合成法(酸化次氯酸鹽法)和髓過氧化物酶(MPO)催化法兩種方法制取次氯酸溶液,通過抑菌實驗和美藍染色法對催化產(chǎn)物進行鑒別。然后加入相應(yīng)的處方成分制備成次氯酸液體敷料。通過單因素實驗對液體敷料所用增稠劑進行優(yōu)選,控制液體敷料的流動性;通過正交試驗優(yōu)化次氯酸液體敷料中次氯酸(HClO)、次氯酸鈉(NaClO)、羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)、磷酸氫二鈉(Na2HP04)的處方用量;考察4℃℃溫度下,避光、光照條件以及不同溫度(4℃、25℃、40℃)條件次氯酸液體敷料的有效氯含量、氧化還原電位(ORP)值的變化情況,對次氯酸液體敷料穩(wěn)定性的影響因素進行探討。采用薄膜過濾法建立次氯酸液體敷料的微生物限度檢查方法,對次氯酸液體敷料進行無菌評價,消除殺菌成分的影響,保證敷料本身無菌。選取傷口感染的常見病原菌大腸桿菌(E.coli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus),其中大腸桿菌為革蘭氏陰性菌的代表,金黃色葡萄球菌為革蘭氏陽性菌的代表,繪制大腸桿菌、金黃色葡萄球菌生長曲線,找到微生物生長對數(shù)期,分別通過抑菌實驗和菌液定量殺滅實驗,計算抑菌圈直徑與殺滅率,驗證次氯酸液體敷料的體外殺菌效果。通過建立與臨床上皮膚軟組織感染較為接近的小鼠模型,驗證次氯酸液體敷料的體內(nèi)殺菌效果。通過醫(yī)用膠帶反復(fù)粘貼(tape stripping,TAP)法破壞小鼠皮膚屏障,于皮膚破損處接種相應(yīng)濃度的大腸桿菌、金黃色葡萄球菌菌液,建立小鼠皮膚軟組織感染模型,設(shè)立觀察指標,給予次氯酸液體敷料進行實驗,驗證殺菌效果。本實驗成功提取了髓過氧化物酶,通過紫外分光光度計與酶標儀分析得知純化后的MPO光譜吸收有兩個特征峰,波長分別為280nm和430nm。經(jīng)不連續(xù)緩沖液系統(tǒng)SDS-PAGE凝膠電泳可知MPO提純液顯示三條帶,與標準質(zhì)量蛋白對照后,可知三條帶的相對分子質(zhì)量為64.7kDa、47.9kDa、13.4kDa。通過MPO測試試劑盒測得MPO酶活性為 5.53U/mL。Bradford 法測定 MPO 的蛋白濃度為 186.3ug/mL。通過實驗室化學(xué)合成法和MPO催化過氧化氫(H2O2)、氯離子(cl-)體系,成功制備了次氯酸溶液。制備的次氯酸為淡黃色溶液,具有含氯消毒制劑的氣味,通過抑菌圈實驗和美藍染色實驗,驗證了 MPO成功催化了 H2O2、cl-。兩種方法制備的次氯酸溶液有效氯含量分別為48.08ppm、106.9ppm;氧化還原電位(ORP)值為177.67mv、272mv。催化產(chǎn)物對于金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑為1.13cm。通過單因素實驗發(fā)現(xiàn)CMC-Na作為液體敷料的增稠劑制備所得次氯酸液體敷料易于涂展,均勻細膩,離心后外觀均勻且保持不變,黏度適宜,體系無氣泡產(chǎn)生,故選用羧甲基纖維素鈉作為液體敷料的增稠劑;通過正交試驗優(yōu)化得出最佳處方用量為次氯酸130uL,羧甲基纖維素鈉2.0g,磷酸氫二鈉0.2g。對次氯酸液體敷料進行穩(wěn)定性考察發(fā)現(xiàn)溫度對于次氯酸液體敷料的穩(wěn)定性影響大,隨著溫度的升高,敷料的有效氯含量、ORP值衰減幅度增大,其中,40℃C條件下,敷料儲存15d,有效氯含量減為0。光照條件與避光條件下,次氯酸衰減幅度相似,未見顯著性差異(p0.05),敷料穩(wěn)定性受光照條件影響遠小于溫度。無菌檢查實驗中,計數(shù)方法驗證結(jié)果顯示實驗組回收率和稀釋對照組回收率均大于70%,控制菌檢查方法適用性實驗結(jié)果顯示,大腸桿菌和金黃色葡萄球菌實驗組均為陽性,對照組均為陰性,均符合中國藥典的要求,消除了敷料本身殺菌物質(zhì)的影響。通過繪制微生物生長曲線發(fā)現(xiàn):在8～14h內(nèi),大腸桿菌數(shù)量顯著增加,達到對數(shù)期;12～22h內(nèi),金黃色葡萄球菌數(shù)量明顯增加,達到對數(shù)期。取次氯酸液體敷料和對數(shù)期菌液進行定量殺滅實驗,結(jié)果表明經(jīng)過10min,敷料對大腸桿菌殺滅對數(shù)值達到7.28,經(jīng)過5min,敷料對金黃色葡萄球菌的殺滅對數(shù)值達到7.72�？梢姶温人嵋后w敷料對于革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌都具有良好的殺滅作用,對于金黃色葡萄球菌的殺滅作用要優(yōu)于大腸桿菌。通過抑菌實驗發(fā)現(xiàn),敷料對大腸桿菌的抑菌圈直徑為0.777cm,對金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑為1.077cm。通過進行動物實驗發(fā)現(xiàn):次氯酸給藥三天后,小鼠皮膚紅腫面積明顯縮小,與給藥前相比,大腸桿菌組小鼠皮膚紅腫面積縮小1.69ccm2,金黃色葡萄球菌組小鼠皮膚紅腫面積縮小2.52 cm2,與空白對照組相比有顯著性差異(p0.05)。感染創(chuàng)面活菌檢查結(jié)果發(fā)現(xiàn)次氯酸液體敷料對于小鼠大腸桿菌感染皮膚殺滅對數(shù)值可達8,對于受金黃色葡萄球菌感染皮膚微生物殺滅對數(shù)值為7.47,表明次氯酸液體敷料對于小鼠傷口感染致病菌有良好的殺滅作用和修復(fù)作用。
【圖文】：

圖１－１次氯酸３Ｄ模型逡逑

逑、邐圖１－１次氯酸３Ｄ模型逡逑次氯酸是生物學(xué)專業(yè)上己知的一個重要的活性殺菌物質(zhì)，是活性氧體系中的一種物逡逑質(zhì)［７＿８］。次氯酸最顯著的化學(xué)性質(zhì)是強氧化性和不穩(wěn)定性，因為在常溫下很容易分解，逡逑所以純的次氯酸很難見到，一般制備出來就立即使用［９］。人體內(nèi)次氯酸由嗜中性粒細胞逡逑（Ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ）產(chǎn)生來殺滅細菌［１（）］，它被廣泛用于含氯消毒劑產(chǎn)品。逡逑１．２．２次氯酸的研究歷程逡逑１９７６年，，次氯酸的殺菌作用首次得到證實。逡逑１９７９年，次氯酸的殺菌機理得到進一步揭示。Ｔｈｏｍａｓ邋ＥＬ發(fā)現(xiàn)次氯酸通過損壞細菌逡逑ＤＮＡ、蛋白（硫醇、硫醚和氨基）、以及酶失活作用，包括切割肽鍵和氧化細菌成分巰逡逑基［１１］
【學(xué)位授予單位】：哈爾濱商業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R943;TB34

【參考文獻】

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本文編號：2613884