【摘要】：在“自下而上”的蛋白質(zhì)組學(xué)策略中,將蛋白質(zhì)酶切生成更小片段的肽段無疑是基于高效液相色譜分離與質(zhì)譜聯(lián)用蛋白質(zhì)組分析方法中最主要和最關(guān)鍵的步驟之一。然而,傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)溶液酶切法通常存在耗時(shí)長(zhǎng)、酶切不完全及酶自切污染等諸多不足,阻礙著蛋白質(zhì)組高效、高通量和深度分析。另外,蛋白質(zhì)的磷酸化修飾和糖基化修飾是兩種最為常見和重要的蛋白質(zhì)翻譯后修飾。由于磷酸化肽段和糖基化肽段的低豐度、低離子化效率以及質(zhì)譜分析時(shí)大量非磷酸化肽段或非糖基化肽段的干擾,使磷酸化蛋白質(zhì)組和糖基化蛋白質(zhì)組分析面臨巨大挑戰(zhàn)。針對(duì)以上問題,通過對(duì)具有不同特點(diǎn)材料的功能化修飾開發(fā)新型固定化酶反應(yīng)器、翻譯后修飾蛋白/肽段的特異性富集方法,可有效解決蛋白質(zhì)組及翻譯后修飾蛋白質(zhì)組高效、高通量及深度覆蓋問題,為蛋白質(zhì)組功能研究奠定基礎(chǔ)�；诖�,本文圍繞功能化超薄二維二硫化鉬納米材料的制備及其在蛋白質(zhì)組研究中的應(yīng)用,開展了以下工作:新型固定化酶反應(yīng)器的制備及其應(yīng)用:通過非共價(jià)鍵疏水堆積作用首先將1-芘丁酸(pyrene-1-butyric acid,1-PBA)固定于磁性二硫化鉬片層表面,然后以共價(jià)鍵合方式結(jié)合胰蛋白酶制備出新型固定化酶反應(yīng)器(Trypsin-PBA@Fe3O4@Mo S2),并將其應(yīng)用于蛋白質(zhì)組快速酶切,實(shí)現(xiàn)對(duì)蛋白質(zhì)組快速分析。由于超薄二維二硫化鉬納米材料的高比表面積而負(fù)載了大量的胰蛋白酶,因而減低了酶與底物之間的空間位阻并有效改善了納米級(jí)材料存在的團(tuán)聚現(xiàn)象。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明新型固定化酶反應(yīng)器具有高效性、穩(wěn)定性及可重復(fù)利用的優(yōu)點(diǎn)。同時(shí),由于表面負(fù)載磁性納米顆粒,使其能從反應(yīng)體系中快速分離與回收。這種新型固定化酶反應(yīng)器能在5分鐘內(nèi)高效地進(jìn)行對(duì)BSA的酶切(氨基酸序列覆蓋率高達(dá)84%),而傳統(tǒng)的溶液酶切需要消耗12小時(shí)且只有74%的氨基酸序列覆蓋率率。進(jìn)一步將該新型固定化酶反應(yīng)器應(yīng)用于He La細(xì)胞和長(zhǎng)柄扁桃(Amygdalus Pedunculata Pall.)種仁蛋白提取物的蛋白質(zhì)組分析,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明使用該新型固定化酶反應(yīng)器能在1小時(shí)酶切處理時(shí)間內(nèi)達(dá)到比傳統(tǒng)溶液酶切處理12小時(shí)更好的效果。通過對(duì)長(zhǎng)柄扁桃種仁蛋白質(zhì)組的功能分析,揭示了長(zhǎng)柄扁桃在嚴(yán)峻沙漠化環(huán)境中能夠良好生長(zhǎng)可能的機(jī)制。新型固定化酶反應(yīng)器的成功應(yīng)用表明其在復(fù)雜生物蛋白質(zhì)組研究中具有很大潛力。新型高選擇性富集磷酸化肽段納米材料的制備及應(yīng)用:迄今為止,雖然已有多種具有不同親和能力和選擇性的磷酸化蛋白/磷酸肽富集材料被開發(fā)用于磷酸化蛋白質(zhì)組研究中,然而,多數(shù)富集材料的制備方法繁瑣復(fù)雜,有待進(jìn)一步改進(jìn)。二硫化鉬是一種具有超薄二維平面結(jié)構(gòu)的高比表面積材料,其特點(diǎn)是表面的負(fù)電性強(qiáng),在不需要任何額外涂層和螯合配體的前提下,可以直接固定大量的鈦離子于超薄二維二硫化鉬納米材料的表面,制備出新型鈦(IV)離子修飾二維二硫化鉬納米材料(Mo S2-Ti4+)。該材料對(duì)磷酸化肽段的負(fù)載量高達(dá)100μg mg-1,富集靈敏度為5 fmol(β-casein),選擇性為1:100。將這種材料用于α-casein酶切產(chǎn)物中磷酸化肽段的富集分析,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該材料對(duì)于低豐度磷酸化肽段的分離與鑒定有著良好的普適性。進(jìn)一步將該功能化材料用于脫脂牛奶胰蛋白酶酶解產(chǎn)物中磷酸化肽段的富集和質(zhì)譜鑒定,可鑒定到12條磷酸化肽段,顯示出該材料在磷酸化蛋白質(zhì)組分析中潛在的優(yōu)勢(shì)。新型高選擇性富集糖基化肽段納米材料的制備及應(yīng)用:為了進(jìn)一步提高對(duì)糖基化肽段富集的高效性,我們采用高比表面積的超薄二維二硫化鉬納米材料為基質(zhì),通過兩次簡(jiǎn)單、穩(wěn)定的'Au-S'鍵反應(yīng)先負(fù)載金納米顆粒,再與含巰基的L-半胱氨酸發(fā)生化學(xué)反應(yīng)制備出新型功能納米材料Mo S2/Au-NP-L-cysteine。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該新型復(fù)合材料可分別從人免疫球蛋白G和辣根過氧化物酶酶解產(chǎn)物中富集鑒定到37條和22條糖基化肽段,同時(shí)具有超低的靈敏度(10 fmol)、超高的選擇性(人免疫球蛋白G與牛血清白蛋白摩爾比為1:1250)、較大的負(fù)載量(120 mg g-1)、高回收率(93%)和穩(wěn)定的制備重現(xiàn)性。將該納米材料用于50μg He La細(xì)胞外泌體中糖基化蛋白質(zhì)組分析,三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)總計(jì)鑒定到源自851種糖基化蛋白的2502條糖基化肽段,說明該功能化納米材料可用于糖基化蛋白質(zhì)組分析和研究。
【圖文】：

西北大學(xué)博士學(xué)位論文 2.2.7 基因本體分析與信號(hào)通路分析對(duì)鑒定到的長(zhǎng)柄扁桃種仁蛋白質(zhì)組通過使用在線 David 6.8 軟件（https://david.ncifcrf.gov/home.jsp）進(jìn)行 GO（基因本體，Gene ontology）生物功能富集分析和 KEGG（京都基因與基因組百科全書，kyoto encyclopedia of genesand genomes）信號(hào)通路分析，GO 注釋結(jié)果按生物過程（biological process）、細(xì)胞組成（cellular component）和分子功能（molecular function）進(jìn)行分類。GO 條目的 p-value 設(shè)定為≤ 0.01。2.3 結(jié)果與討論2.3.1 新型固定化胰蛋白酶反應(yīng)器的制備與表征

型固定化酶反應(yīng)器 Trypsin-PBA@Fe3O4@MoS2的使用量對(duì)酶切效igure 2-4. The influence of loading dosage of Trypsin-PBA@ Fe3O4@Mo統(tǒng)的溶液酶切相比，固定化酶反應(yīng)器酶切處理的最大特點(diǎn)之一縮短酶切處理所需時(shí)間。我們利用 0.1 mg 新型固定化酶反應(yīng)器性溶液在 37 °C 下反應(yīng)不同的酶切時(shí)間，考察了新型固定化酶反中的酶切時(shí)間的影響并進(jìn)行優(yōu)化。如圖 2-5 所示，由新型固定效率隨時(shí)間的變化結(jié)果可以看出，新型固定化酶反應(yīng)器的酶切的增加而增高，當(dāng)酶切時(shí)間大于 5 分鐘后，，BSA 的氨基酸序恒定(84%、圖 2-6b)。與溶液酶切相比，新型固定化酶反應(yīng)器84%、圖 2-6b 和表 2-1）明顯優(yōu)于傳統(tǒng)的溶液酶切的酶解效率和表 2-2），并且將酶解時(shí)間由 12 小時(shí)縮短為 5 分鐘，因此，后鐘酶切時(shí)間。另外，新型固定化酶反應(yīng)器可以使用磁鐵快速、
【學(xué)位授予單位】：西北大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：TQ136.12;TB383.1;Q51

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6 黃義;史艷梅;張z齜

本文編號(hào)：2607112