酶—無(wú)機(jī)物晶體復(fù)合納米花的制備及其生物催化應(yīng)用研究

發(fā)布時(shí)間：2020-03-30 00:06

【摘要】：酶催化在有機(jī)合成中是一種有效且綠色的生物轉(zhuǎn)化手段,但是由于酶穩(wěn)定性差,不易分離(即難回收),這限制了其在合成中更進(jìn)一步的發(fā)展。酶固定化技術(shù)正好在穩(wěn)定性、可回收利用等方面具有優(yōu)勢(shì),但是傳統(tǒng)的固定化酶普遍有活性降低的缺點(diǎn),這在一定程度上限制了它在工業(yè)上的應(yīng)用。而如今出現(xiàn)了一種既簡(jiǎn)單又有效的固定化技術(shù),即酶-無(wú)機(jī)物晶體復(fù)合納米花的制備。酶晶體中的酶活性中心通過(guò)無(wú)機(jī)載體限制在特定的空間,具有細(xì)胞環(huán)境類似的限域效應(yīng)。本文在制備無(wú)機(jī)物-酶晶體的基礎(chǔ)上,利用酶晶體具有限域催化的優(yōu)點(diǎn),將其應(yīng)用在有機(jī)合成中,并讓無(wú)機(jī)金屬鹽同時(shí)作為載體和助催化劑成為可能。本論文采用酶-無(wú)機(jī)物共結(jié)晶方法,制備出木瓜蛋白酶-磷酸銅晶體復(fù)合納米花,并用于混亂催化Knoevenagel縮合反應(yīng)。酶晶體首先通過(guò)混合的硫酸銅水溶液和在磷酸鹽緩沖液中的酶在室溫下制備而成。得到的酶晶體通過(guò)SEM表征,且其活力通過(guò)N-苯甲酰-DL-精氨酸對(duì)硝基酰胺鹽酸鹽作為底物的水解反應(yīng)來(lái)檢測(cè)。分析結(jié)果顯示磷酸銅酶晶體的負(fù)載率為94.5%,在最適條件下該酶晶體的水解活性是游離酶的15倍,且有很好的熱穩(wěn)定性。選取了一系列的條件(反應(yīng)溫度,時(shí)間和溶劑)研究并考查其對(duì)縮合反應(yīng)產(chǎn)物產(chǎn)率的影響。在最適條件下,當(dāng)苯甲醛和乙酰丙酮作為底物時(shí),酶晶體催化得到的產(chǎn)率是游離酶催化的1.25倍。同時(shí)結(jié)果發(fā)現(xiàn)酶晶體在循環(huán)催化72 h后仍保持初始活性的87.8%,同時(shí)與游離酶相比,其穩(wěn)定性也大大提高。而當(dāng)進(jìn)一步進(jìn)行底物拓展時(shí),大部分結(jié)果表示酶晶體的催化活性比游離酶好。結(jié)果還發(fā)現(xiàn)當(dāng)其余反應(yīng)條件相同時(shí),不飽和醛上的取代基為強(qiáng)吸電子基團(tuán)時(shí)比強(qiáng)供電子基團(tuán)具有更好的產(chǎn)率,同時(shí)推測(cè)銅離子可能有降低不飽和醛上電子云密度的作用,促進(jìn)碳碳鍵的生成。鑒于銅離子重金屬離子的毒性會(huì)對(duì)人體和環(huán)境造成危害,不適合用于藥物合成中,故選用鈣離子來(lái)代替銅離子制得酶-磷酸鈣復(fù)合納米花。本文選擇了6種酶(包括木瓜蛋白酶,菠蘿蛋白酶,胰蛋白酶,疏綿狀嗜熱絲孢菌脂肪酶-TLL,南極假絲酵母脂肪酶B-CALB,胰蛋白酶-PPL)來(lái)制備酶-無(wú)機(jī)物酶晶體復(fù)合納米花。得到的酶晶體的負(fù)載率都在95%左右,且都比游離酶表現(xiàn)出更好的活性和熱穩(wěn)定性。使用過(guò)的酶晶體可通過(guò)加入磷酸來(lái)溶解納米花,并通過(guò)加熱使蛋白變性分離,從而回收納米花中的磷酸鈣、磷酸氫二鈣和磷酸二氫鈣。通過(guò)重量檢測(cè),發(fā)現(xiàn)磷酸鈣的回收率都在95%以上。此外,用回收的磷酸鹽制備的酶晶體活性幾乎不變。酶被磷酸鈣限定在特定的空間,形成限域空間,酶與底物在特定的空間內(nèi)能夠更有效地結(jié)合,促進(jìn)反應(yīng)速率。將其中TLL制備得到的磷酸鈣酶晶體用于催化克林霉素棕櫚酸酯的合成中。其水解活性在最適條件下是游離酶的8.2倍且有較好的熱穩(wěn)定性。本文利用骨頭中含有的大量磷酸鈣,將其作為無(wú)機(jī)成分制備得到TLL酶晶體,其被稱為天然源TLL酶晶體,其酶活是游離酶的8.9倍。在以石油醚為溶劑的條件下,酶晶體能催化得到69.6%的產(chǎn)率,游離酶能得到79.1%的產(chǎn)率。雖然游離酶催化的產(chǎn)率比酶晶體好,但是酶晶體可以進(jìn)行循環(huán)催化,且催化活性在循環(huán)10次后(12 h/次)仍舊保持在90%以上。在酶晶體催化合成維生素A棕櫚酸酯中,在最適條件下,酶晶體催化能夠得到90.39%的產(chǎn)率,而游離酶催化只能得到61.31%的產(chǎn)率,且酶晶體循環(huán)催化10次(12 h/次)后還有73.2%的相對(duì)產(chǎn)率�？傊�,在本文中通過(guò)酶-無(wú)機(jī)物共結(jié)晶的方法制備了酶-無(wú)機(jī)物復(fù)合納米花,實(shí)現(xiàn)了酶蛋白的簡(jiǎn)易固定化。無(wú)機(jī)物晶體的包埋使得酶蛋白在催化中呈現(xiàn)出一定的限域效應(yīng),以致酶蛋白穩(wěn)定性和活性得以大幅提高。同時(shí),在酶-磷酸鈣復(fù)合納米花的進(jìn)一步研究中,通過(guò)磷酸鈣結(jié)晶、酸解和再結(jié)晶方法,可回收和重復(fù)使用納米花中的無(wú)機(jī)組分磷酸鈣,從而實(shí)現(xiàn)酶和無(wú)機(jī)載體的雙循環(huán),避免了固定化酶過(guò)程中金屬離子污染、載體難回收問題。而將酶-磷酸鈣晶體復(fù)合納米花用于棕櫚酸酯類藥物合成中,以其高活性、高穩(wěn)定性及多次循環(huán)利用可有效降低相應(yīng)藥物的制備成本,因此酶-無(wú)機(jī)物晶體復(fù)合納米花固定化方法可進(jìn)一步豐富和推動(dòng)酶固定化和催化理論與應(yīng)用研究的發(fā)展。
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